ЧЕРКАСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНIВЕРСИТЕТ IМ. БОГДАНА ХМЕЛЬНИЦЬКОГО природничий факультет кафедра фiзiологii P ВПЛИВ МАЛИХ ДОЗ РАДIIМУНIТЕТ Дипломна робота студента 5 курсу природничого факультету Науковий керiвник доктор бiологiчних наук Черкаси – 1996 р. ЗМIСТ Вступ 1. Огляд лiтератури 1.1 Iсторiя дослiджень 3 1.2
Загальна характеристика лейкоцитiв 1.3 Характеристика Т- i В-лiмфоцитiв 9 1.4 дiя iонiзуючого випромiнювання на Т-клiтинний iмунiтет 13 1.5 Дiя iонiзуючого випромiнювання на органiзм людини 2. Матерiали i методи дослiдження 2.1 Характеристика обстежених груп 2.2 Методика визначення субпопуляцiй Т-лiмфоцитiв 22 2.3
Методика пiдрахування числа лейкоцитiв вкровi 2.4 Методика визначення диференцiйованоi формули лейкоцитiв 2.5 Визначення рiвня CD3 ,CD4 ,CD5 ,CD8 . лiмфоцитiв у периферичнiй кровi 2.6 Статистична обробка даних 3. Стан клiтинного iмунiтету у практиноздорових студентiв ЧДУ 4. Стан клiтинного iмунiтету у осiб, що проживають в зонi посиленого радiацiйного контролю 33 5.
Висновки 42 Лiтература 43 IСТЬ РОБОТИ На даний час вважасться доведеним, що сильна або тривала дiя ряду неспецифiчних факторiв навколишнього середовища може призво- дити до порушень клiтинного iмунiтету Значне мiсце серед цих факторiв займас iонiзуюче вип- ромiнювання. Встановлено, що гостра дiя радiацii призводить до порушень в кiстковому мозку та тимусi.
Наслiдком цих змiн с зниження iмунноi вiдповiдi органiзму за рахунок спiввiдношень лiмфоцитарних субпопуляцiй. Iонiзуюче випромiнювання може викликати безлiч морфо- логiчних i функцiональних змiн iзсторони iмунноi системи людини. Порушення функцiй iмунноi системи можуть бути причиною ви- никнення ряду захворювань аутоiмунний тиреозит, бронхолегеневi захворювання, виникнення добро-та злоякiсних пухлин i iн. Враження iмунокомпетентних клiтин веде до формування вторин- ного iмунодефiциту, структура i вираженiсть якого залежить вiд характеру та дози випромiнювання, а також вихiдного функцiо- нального стану опромiненого органiзму, та ступенi ураження ор- ганiв, що обумовлюють функцii iжмунноi системи. Патогеннi змiни функцii iмунноi системи, iх проявлення дас змогу профiлактики та вчасному лiкуванню тих захворювань в пато- генезi яких лежить порушення iмунного гомеостазу. Це робить питання дослiдження впливу iонiзуючого випромiню- вання на iмунну систему актуальним.
МЕТОЮ дипломноi роботи с вивчення вiддаленоi дii аварii на ЧАЕС на клiтинний iмунiтет населення Украiни. ЗАДАЧI якi ставилися для досягнення цiсi мети 1. Украiни. 2. Вивчення модифiкацii Т-лiмфоцитарних рецепторiв у сту- дентiв, що зазнали впливу малих доз радiацii внаслiдок аварii на ЧАЕС 3. Порiвняльний аналiз впливу малих доз радiацii на
Т-клiтин- ний iмунiтет студентiв рiзних факультетiв ЧДУ. НАУКОВА НОВИЗНА Вперше дослiджено вплив на iмунiтет дii комбiнованого iунiзуючого випромiнювання. ПРАКТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ РОБОТИ Дипломна робота виконана в рамках теми, що викладасться в ЧДУ по замовленню Мiнiстерства Освiти Украiни Вплив малих доз радiацii на клiтинний iмунiтет . 1. Огляд лiтератури. 1. Iсторiя дослiджень. Проблема впливу iонiзуючого випромiнення на органiзм
людини i тварин с однiю з найважливiших в екологiчнiй медицинi, почина- ючи з 40-х рокiв нашого сторiччя. В березнi 1954 року на дослiдницькому полiгонi Маршаловi острови, США було проведено вибух термоядерноi бомби з експери- ментальною метою. В результатi вибуху мало мiсце осадження радi- оактивних речовин на населених аттолах.Проведенi дослiдження по- казали, що в районах випадання радiоактивних речовин була висока радiоактивна забрудненiсть. Значне число осiб як серед мiсцевого населення, так i серед учасникiв дослiджень одержали радiацiйнi враження в тiй чи iншiй мiрi. В результатi дослiджень за потерпiлими були зiбранi цiннi вiдомостi, що висвiтлюють деякi аспекти дii iонiзуючоi радiацii на людину. Початковi данi були доповненi повторними спостережен- нями через 6 та 24 мiсяцi з моменту враження. На основi порiвня- ння одержаних результатiв iз наявними даними про враження людей у
Хiросiмi та Нагасакi, а також матерiалами, одержаними при не- щасних випадках у лабораторiях та при експериментах iз тваринами було зроблено спробу встановити гранично допустиму дозу випромi- нення для людини. Було доведено, що -випромiнення найбiльш небезпечне в рай- онi випадання осадiв, воно с проникаючим iйого вплив може викли- кати таке ж гостре променеве враження, яке спостерiгалось у япо- нцiв у Хiросiмi та Нагасакi. Опромiнення шкiри -променями небе- зпене i при вiдсутностi -випромiнення.
Незважаючи на те,що шкi- рне враження iнодi з являсться пiзно, воно може привести до тяж- ких наслiдкiв. У осiб, що зазнали дii радiоактивних осадiв, може спостерi- гатися внутрiшнс забруднення радiоактивними речовинами.Кiлькiсть радiоактивних речовин, депонованих у кiстковiй тканинi, виявила- ся невеликою i не викликала гостроi реакцii. Вважали, що вражен- ня, якi розвиваються при цьому, нетривалi i нетяжкi,особливо як- що прийняти мiри захисту проти надмiрного вдихання радiоактивних матерiалiв.
Основними проблемами медичного контролю в мiсцях ви- падання радiоактивних осадiв вважали питання,пов язанi з загаль- ним – та -опромiненням шкiри матерiалiв. Основними проблемами медичного контролю в мiсцях ви- падання радiоактивних осадiв вважали питання,пов язанi з загаль- ним – та -опромiненням шкiри Особливо цiкаву групу дослiджень склали лабораторнi тести по впливу iонiзуючого випромiнення на стан iмунноi системи та фу- нкцiональну здатнiсть ii складових. Так, дослiди по вивченню ран- нiх Т-клiтин продемонстрували статистично-достовiрне вiково-зале- жне пiдвищення рiвня CD3-4 8- -лiмфоцитiв у периферичнiй кровi потерпiлих. Але загальний рiвень Т-клiтин знижувався, можливо, внаслiдок вiково-специфiчноi деградацii Т-клiтинних функцiй. Чи- сло натуральних кiллерiв НК та клiтин-попередникiв цитотоксич- ноi активностi значно пiдвищувалося у старих людей, що зазнали впливу радiацii.
Було також встановлено, що щорiчне збiльшення середньоi час- тоти соматичних мутацiй в опромiненого населення на одну величину бiльше в Т-клiтинному рецепторному комплексi та в HLA-A2 Як бачимо, наведенi дослiдження продемонстрували, що один з найбiльш яскравих ефектiв впливу радiацii на органiзм людини ха- рактерний саме для iмунноi системи. Пiдтвердженням цьому стали дослiдження, проведенi пiсля аварii на
Чорнобильськiй АЕС. У результатi катастрофи на ЧАЕС виникло радiоактивне забру- днення мiсцевостi не лише на територii Cвропи, але й за ii межа- ми – в США, Китаi та Японii В умовах радiоактивного забруднення основне дозове наванта- ження формують радiонуклiди, що потрапляють в органiзм людини з харчовими продуктами, iстотно впливаючи на стан здоров я населен- ня. Аварiя на ЧАЕС призвела до виникнення безпрецендентного для мирного часу становища, коли об сктом
дii малих доз iонiзуючоi радiацii стали багатотисячнi контингенти населення. Оскiльки до спектра пов язаних iз Чорнобильською катастро- фою радiонуклiдiв входять довгоживучi радiоiзотопи, очевидно, що ситуацiя, яка виникла, значною мiрою визначатиме стан здоров я населення Украiни принаймi у найближчiй iсторичнiй перспективi. Все це вимагас детального вивчення наслiдкiв опромiнення малими дозами iонiзуючоi радiацii фiзiологiчних систем органiзму люди- ни. Серед останнiх важливе мiсце знову ж таки належить iмуннiй системi, оскiлькивона с рiвноправною ланкою нейроiмуноендокрин- ного регуляторного контуру, порушення з боку якого вiдiграють ви- значну роль у патогенезi найпоширенiших хронiчних захворювань атеросклероз, злоякiснi новоутвори, дiабет, аутоiмуннi процеси та iн. Слiд мати на увазi, що на вiдмiну вiд iнших фiзiологiчних систем, визначення показникiв iмунiтету, як правило, проводить- ся в статичному режимi, а не в режимi функцiональних
наванта- жень, що обмежус можливiсть судження про функцiональний резерв тестованоi системи, який визначас в кiнцевому рахунку ii адап- тивнi можливостi. Любченко П.Н. з спiвавт. 1990 вiдмiчають, що при впливi iонiзуючоi радiацii вражасться перш за все клiтинний iмунiтет антигенрозпiзнаюча ланка 1.2 ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ЛЕЙКОЦИТIВ Лiмфоiднi клiтини, з якими зв язанi всi iмуннi механiзми, з являються, дозрiвають та функцiонують
в рiзних органах. В них знаходяться клiтини з обмеженим транспортом в органiзмi, а також багаточисельнi рециркулюючi клiтини. До клiтин iмунноi системи вiдносять лiмфоцити агранулоцити – В- i Т-лiмфоцити незернистi лейкоцити . Лейкоцити вiдносять до бiлих кров яних клiтин. В них с ядро i цитоплазма. Значне число лейкоцитiв в кровi дорослоi людини – в 1 мкл 6-8 тис. Однак iх чисельнiсть може змiнюватись вiд часу доби, функцiонального ста- ну органiзму.
Розрiзняють фiзiологiчний i реактивний лейкоцитоз збiльшення числа лейкоцитiв . Перший частiше спостерiгасться пiсля вживання iжi, пiд час вагiтностi при м язевiй роботi, сильних емоцiях, вiдчуттi болю. Другий вид характерний для запальних процесiв та iнфекцiйних захворювань. Фiзiологiчний лейкоцитоз по своiй природi являсться перероз- подiльним. Реактивний лейкоцитоз обмовлений пiдвищенням викиду iз органiв кровоутворення клiтин i пероеважно молодих. В цьому приймас участь кiстковий мозок, легенi, селезiнка Лейкопенiя – зменшення кiлькостi лейкоцитiв характеризус протiкання деяких iнфекцiйних захворювань. Спостерiгасться в ос- таннi роки неiнфекцiйна лейкопенiя, пов язана головним чином з пiдвищеннямрадiацiйного фону. Особливо гострою вона бувас при уш- кодженнi кёсткового мозку в результатi опромiнення Кiлькiсне спiввiдношення рiзних видiв лейкоцитiв периферичноi кровi називають лейкоцитарною формулою.
Вiдхилення лейкоцитарноi формули являсться важливим дiагностичним показником при рiзно- манiтних захворюваннях В нормi вона являс слiдуюче спiввiдношення в базофiли 0 – 1 еозинофiли 0,5 – 5 паличкоядернi нейтрофiли 1 – 6 сегментоядернi нейтрофiли 47 – 72 лiмфоцити 19 – 37 моноцити 3 – 11 Всi види лейкоцитiв володiють амебоiдною рухливiстюидкiсть ру- ху може досягати до 40 мкм хв. При наявностi певних хiмiчних подразникiв лейкоцити можуть виходити
через ендотелiй капiлярiв i спрямовуватись до подразни- ка, мiкробiв клiтин, якi розпадаються чужородного тiла або ком- плексу антиген-антитiло. По вiдношенню до них лейкоцити во- лодiють позитивним хемотаксисом. Свосю цитоплазмою лейкоцити здатнi оточити чужородне тiло i за допомогою спецiальних фер- ментiв перетравлювати його фагоцитоз . Один лейкоцит може захопити 15-20 бактерiальних клiтин моно- цит . У лейкоцитах мiститься цiлий ряд ферментiв пептидази, лiпа- зи .
В звичайному станi ферменти знаходяться в лiзосомах – iзольовано. Лейкоцити здатнi адсорбувати деякi речовини i перено- сити iх на своiй поверхнi. Бiльше 50 всiх лейкоцитиi розмiщусться за межею судинного русла – гiстоцити, 30 у кiстковому мозку. По вiдношенню до лей- коцитiв кров виконус транспортну функцiю, доставляючи iх вiд мiсця утворення до рiзних органiв В залежностi вiд того, мiстить цитоплазма зернистiсть чи во- на однорiдна, лейкоцити дiлять на 2 групи гранулоцити i агрануло- цити Гранулоцити становлять 60 всих лейкоцитiв кровi, час iх життя приблизно 2 доби. Гранулоцити подiляють на види 1. Еозинофiли – гранули яких забарвлюються кислими фарбами в рожевий колiр 2.Базофiли – основними фарбами синiй колiр 3.Нейтрофiли – здатнi сприймати тi i другi фарби розово-фiо- летовий колiр . Збiльшення числа еозинофiлiв – еозинофiлiя, виникас при алергiчнiй реакцii, при
цьому в органiзмi утворюються антитiла проти власних клiтин На мембранi базофiлiв с рецептори до яких присднуються певнi глобулiни плазми кровi. Так утворюсться iмунний комплекс. Iз гра- нул звiльнясться гiстимiн, який викликас розширення судин, спазм бронхiв, свербiж. Нейтрофiли в залежностi вiд вiку мають ядро рiзноi форми полiморфоядернi у юних – ядро кругле у молодих – у виглядi палички зрiлi – сегментоядернi.
З вiком ядро клiтин перешнуро- вусться i роздiлясться на декiлька сегментiв Нейтрофiли с найбiльшважливими елементами неспецифiчного за- хисту системи кровi, якi здатнi знешкоджувати навiть такi чуже- роднi тiла з якими органiзм ранiше не зустрiчався. Вони накопи- чуються в мiсцях пошкодження тканин або проникнення мiкроро- ганiзмiв, захоплюють i перетравлюють iх. Нейтрофiли адсорбують аьо видiляють на поверхнiмембран антитiла проти мiкробiв i чу- жерiдних бiлкiв.
I таким чином нейтрофiли теж забеспечують iмун- ний механiзм захисту. Агранулоцити незернистi лейкоцити подiляють 1. Моноцити 2. Лiмфоцити Моноцити – самi великi клiтини кровi, вони мають округлу фор- му i добре виражену цитоплазму. Моноцити також здатнi до аме- боiдного руху i характеризуються самою високою фагоцитарною ак- тивнiстю. 1.3 ХАРАКТЕРИСТИКА Т- I В-ЛIМФОЦИТIВ В залежностi вiд функцiональних властивостей розрiзняють 2 основнi класи лiмфоцитiв Т- та В-клiтини. Тимусозалежнi лiмфоцити Т-лiмфоцити , в свою чергу, утво- рюють ряд пiдкласiв. Однi з них забезпечують виконання регулято- рних функцiй, зокрема, можуть допомагати хелпери чи по- давляти супресори розвиток iмунноi вiдповiдi, в тому числi утворення антитiл. Iншi виконують ефекторнi функцii, наприклад, виробляють розчиннi реовини, якi сприяють виникненню реакцiй
за- палення або здiйснюють пряме руйнування клiтин, що несуть на со- бi антигени. Таким чином, видiляють Т-хелпери, Т-супресори, Т-кiллери та Т-клiтини реакцiй сповiльненоi гiперчутливостi. Т-лiмфоцити утворюються з стволових клiтин кровотворних тка- нин i проходять стадiю дозрiвання в тимусi. До цього часу остаточ- но не вирiшили, один чи рiзнi попередники для хелперних, супре- сорних та цитотоксичних клiтин.
С вiдомостi, що тiмоцити мозковоi зони належать до iншого ряду диференцiювання, нiж тiмоцити кiрко- воi зони. Вiдомо також, що основну масу клiтин тимусу складають субпопуляцii CD4-8 CD4 8 , CD4 8 CD4-8 подвiйнi негативнi, подвiйнi позитивнi, одинарнi позитивнi клiтини . Подвiйнi негативнi – незрiлi immature , CD4-8- переважають у тимусi ембрiонiв. Iх кiлькiсть зростас при регенерацii тимусу пiсля опромiнення.
По властивостям i фенотипу вони близькi до кi- стково-мозкових попередникiв тiмоцитiв. Цi клiтини, що несуть CD5 -антиген CD4-8-5 , забезпечують генерацiю 3-х основних суб- популяцiй тiмоцитiв CD4 8 ,CD4 8 CD4-8 . Подвiйнi позитивнi клiтини вважаються незрiлими i нездатними до подальшого дозрiвання, вони приреченi на загибель у тимусi. Одинарнi позитивнi клiтини – майже зрiлi,але не iдентичнi пе- риферичним Т-клiтинам. Лiмфоцити периферичноi кровi належать до клiтин з комплекс- ним типом антигенноi специфiчностi. Вони здатнi розпiзнавати од- ночасно продукти власних МНС-генiв гени головного комплексу гiс- тосумiсностi та чужорiднi антигени. Головний комплекс гiстосумi- сностi – основна генетична система, що визначас функцiонування мунноi системи, i, перш за все, Т-системи iмунiтету. Видiляють 2 групи молекул головного комплексу гiстосумiсностi – молекули МНС класу I та молекули МНС класу II. Молекули
МНС класу I – мембраннi глiкопротеiни,виявленi бук- вально в усих клiтинах. У людини 3 локуси, що кодують молекули класу I – HLA-A, HLA-B, HLA-C. Молекули класу I визначають специфiчнiсть впiзнавання мiшенi алогенними клiтинами-кiллерами i розпiзнаються разом з вiрусами, пухлинними та iншими мембранними антигенами цитотоксичними Т-клi- тинами. Молекули МНС класу II у людини HLA-Dr та
HLA-Dc вiдiграють головну роль у стимуляцii пролiферацii алогенних Т-клiтин,що скла- дас основу iмунноi вiдповiдi у змiшанiй культурi лiмфоцитiв. Роз- пiзнаються Т-хелперами та iншими Lyt 1 -клiтинами, що виробляють IЛ-2 для посилення цитотоксичноi активностi . Розглянемо окремi пiдкласи Т-клiтин. Т-хелпери iндуктори . Iснус три типи цих клiтин.
Перший – iмфоцити, що впiзнають елементи головного комплексу гiстосумiс- ностi. Вони мають специфiчнiсть до антигенiв, зв язаних iз влас- ними Iа-бiлками. Цi лiмфоцити iндукують пролiферацiю В-клiтин i iх диференцiювання до антитiл-утворюючих клiтин. Другу групу скла- дають Т-хелпери, що впiзнають iмуноглобулiни. Вони володiють спе- цифiчнiстю як до антигену, так i до власних iзотопiчних детермi- нант.
Активують В-клiтини, що мають такi ж детермiнанти. Третя група Т-хелперiв секретус лiмфокiнiн IЛ-2 . Вони впiзнають анти- ген у комплексi з власними Ia-детермiнантами. Регуляторна функцiя Т-хелперiв полягас в здатностi стимулю- вати В-клiтини до пролiферацii i диференцiацii в антитiлоутворюючi клiтини. Вiдповiдь В-клiтини на бiльшiсть бiлкових антигенiв пов- нiстю залежить вiд допомоги Т-клiтин. Такi антигени – тимусозалеж- нi. Допомога Т-хелперiв здiйснюсться двома способами. Перший – пряма взасмодiя Т-хелпера i реагуючоi В-клiтини когнантна допомо- га . У цьому випадку Т-клiтина розпiзнас детермiнанти антигенноi молекули, уже фiксованоi на
В-клiтинi. Також розпiзнаеться продукт МНС-гена на поверхнi В-клiтини МНС класу II . Другий спосiб поля- гас в утвореннi розчинних неспецифiчних хелперних факторiв – лiм- фокiнiнiв. Це обидва фактори росту в першу чергу фактор, що регу- люс пролiферацiю В-клiтин i вiдповiдь на антигенну стимуляцiю . Одна й та ж Т-клiтина може здiснювати хелперну функцiю як на основi когнантноi взаемодii, так i з допомогою медiатора.
Деякi Т-клiтини вiдiграють роль пiдсилювача хелперноi дii. Вони дiють на вже стимульованi В-клiтини. Т-супресори складають групу клiтин, якi здатнi пригнiчувати iмунну вiдповiдь. Т-супресори дiють, регулюючи чисельнiсть Т-хел- перiв. Прямий вплив цих клiтин на В-лiмфоцити вивчений недостатньо. Супресорна система включас три клiтиннi форми. Форма
Ts 1 спе- цифiчна до антигену i виробляе фактор TsF 1. Вiн активус Ts 2, cпе- цифiчний проти iдiотипiв антитiл до антигену, зв язаного Ts 1. TsF 2 активус клiтину TsF 3, яка супресорно дiс на хелпернi Т-клi- тини. Iснують також Т-контрсупресорнi клiтини з фенотипом Ly 1 .Во- ни запобiгають iнактивацii Т-хелперiв супресорними клiтинами.
Вiдi- грають важливу роль для розвитку iмунологiчноi толерантностi при активнiй супресii. T-цитотоксичнi клiтини несуть маркери, схожi iз супресорними клiтинами Lyt 2 .Вони лiзують клiтини, що несуть на поверхнi ан- тигени, до яких специфiчнi данi лiмфоцити. Перша стадiя лiзису – розпiзнавання антигену i молекул кла- су I на поверхнi клiтини-мiшенi. Далi йде руйнування цiсi клiтини. Т-цитотоксичнi клiтини можуть брати участь в декiлькох циклах лi- зису, самi при цьому не руйнуючись. Iх називають ще Т-кiллерами. Кiллернi клiтини вiдiграють важливу роль в захистi вiд вiрусних захворювань та в протипухлинному iмунiтетi. Особливу групу складають природнi кiллери ПК . Вони здатнi вбивати деякi види пухлинних клiтин, використовуючи зовсiм iншi способи розпiзнавання, нiж Т- i В-лiмфоцити . Iснують данi про рiзноманiтну радiочутливiсть популяцiй i субпопуляцiй лiмфоцитiв
найбiльш радiочутливими вважаються Т-су- пресори, а найбiльш радiорезистентними – Т-хелпери Проте деякi автори вважають, що вiдмiнностi в радiочутливо- стi в умовах in vivo можуть бути обумовленi якимись певними фак- торами, можливо навiть рiзними пропорцiйними спiввiдношеннями окремих лiмфоцитних субпопуляцiй. Тому N. Nakamura з спiвавтора- ми 1990 оцiнили вiдповiдь кожноi субпопуляцii Т-лiмфоцитiв на iонiзуюче випромiнення в умовах in vitro.
Дослiдники використали методику клонування Т-клiтин у присутностi фактору росту iнтер- лейкiну-2 IL-2 . Дослiдження показали, що фракцiя колонiй лiм- фоцитiв CD4 становила 30-50 вiд загальноi кiлькостi клiтин i фракцiя колонiй CD8 – 15-20 . Взагалi, бiльше 97 сортованих клiтин несли на своiй поверхнi CD4 чи СD8 -поверхневi антигени. Доза опромiнення не перевищувала 5
Гр, оскiльки при бiльшiй дозi клiтини гинуть. Результати чiтко продемонстрували, що радiочутливiсть CD4 i CD8 -лiмфоцитiв дуже схожа. Аналiз колонiй несортованих лiм- фоцитiв показав, що вони несуть поверхневi маркери CD4- i CD8- тобто, не мають хелперних чи супресорних властивостей . Хоча не було точно визначено, чи присутнiй на них маркер дорослих лiмфо- цитiв CD3, вченi вирiшили, що бiльшiсть iз них – натуральнi кiл- лери. Виявилося, що радiочутливiсть цих клiтин також не вiдрiз- нясться вiд радiочутливостi CD4 чи CD8 . N.Nakamura робить вис- новок, що в умовах in vitro гiпотеза про найбiльшу радiочутли- вiсть Т-супресорiв не пiдтверджусться. Можливо, в цих умовах пе- реважну бiльшiсть клiтин з поверхневим антигеном CD8 складають тi, що не виконують супресорних функцiй 1.4 ДIЯ IОНIЗУЮЧОГО ВИПРОМIНЮВАННЯ НА Т-КЛIТИННИЙ IМУНIТЕТ
Як же реагують попередники Т-лiмфоцитiв на iонiзуючче опромi- нення? Вплив радiацii на iмунну систему зокрема, ii тимусозалежну ланку вивчений недостатньо. Т.Ю.Харченко зi спiвавт. 1994 прове- ли дослiдження на мишах, здiйснивши опромiнення в перiод органоге- незу. Закладка i формування тимусу мишей проходить на 7-12 добу ро- звитку ембрiону. Саме в цей перiод органiзм найбiльш чутливий до дii iонiзуючого опромiнення, його результатом може
бути спотворен- ня або загибель новонароджених. На 9-ту добу ембрiонального розвитку мишей закладасться стро- ма тимусу, на 13-ту – закiнчусться перша хвиля заселення тимусу лiмфоiдними попередниками, проходить формування кiркового i мозко- вого шарiв тимусу, здiйснюсться перебудова генiв – i -ланцюгiв рецептора Т-клiтин для Thy-антигену. До 17-i доби завершусться пе- ребудова генiв клiтинного рецептору, проходить його експресiя на поверхнi тiмоцитiв, формуються основнi субпопуляцii
СD4-8 CD4 8 , CD4-8 , CD4 8- -тiмоцитiв. З цими ж термiнами пов язана друга хвиля заселення тимусу клiтинами-попередниками Т-лiмфоцитiв. В цi критичнi термiни розвитку тимусу опромiнювали вагiтних самок з наступним дослiдженням вмiсту i популяцiйного складу клi- тин тимусу i селезiнки. Дози опромiнення варiювали вiд 0,15 до 4 Гр. Аналiз проводили в першу добу i через 2 тижнi пiсля народже- ння. При опромiненнi на 9-й день вагiтностi плiд гинув при дозi 0,5 Гр, на 13-ту добу – при дозi 0,7 Гр, при опромiненнi на 17-ту добу доза 0,15-4 Гр не перешкоджала вагiтностi i пологам. Виявилося, що при дозi радiацii, меншiй 1 Гр, значних змiн у клiтинностi тимусу немас. А при дозах 0,15 i 0,3 Гр спостерiгасть- ся навiть пiдвищення клiтинностi. Опромiнення в дозах 1, 2 i 4 Гр на 17-ту добу розвитку приводить до зниження клiтинностi тимусу i селезiнки,
доза в 1 Гр на 13-ту добу – до зниження клiтинностi ли- ше в селезiнцi. Можливо, тiмоцити в цей перiод бiльш резистентнi, нiж в пiзнiшi термiни. Справдi, на 13-ту добу розвитку 100 тiмо- цитiв складають СD4-8- -попередники Т-клiтин, яким властива до- сить висока радiорезистентнiсть. Данi свiдчать про вищу радiорезистентнiсть тiмоцитiв 17-ти до- бового плоду, нiж тiмоцитiв дорослих
мишей. Очевидно, i в цьому ви- падку мова йде про рiзне спiввiдношення субпопуляцiй тiмоцитiв, що вiдрiзняються в радiочутливостi. Дiйсно, вмiст радiорезистентних CD4-8- -клiтин складас в цей перiод 40 , тодi як у дорослих мишей 3-5 . I все ж у опромiнених в ембрiональний перiод мишей сплостерi- гасться вiдставання в клiтинностi тимусу, яке при дозi менше 1 Гр лiквiдусться на 30-ту добу пiсля цього клiтиннiсть навiть вища, нiж у неопромiнених
. При дозi бiльше 2 Гр вiдставання залишасться i пiд кiнець мiсяця. Для клiтин селезiнки характернi глибшi змiни, якi не лiквiдуються до 30-i доби життя. Зате при опромiненнi в до- рослому вiцi клiтиннiсть тимусу швидше вiдновлюсться у мишей, якi були опромiненi у перiод внутрiшньоутробного розвитку. Вмiст у тимусi i селезiнцi Thy 1 , CD4 та CD8 -клiтин прак- тично не вiдрiзнясться по вiдносному складу вiд контролю опромi- нення
проведене на 14-ту добу вагiтностi, оцiнка стану – через 14 дiб пiсля народження . Вченi роблять висновок, що описанi вище змiни у вмiстi тiмоцитiв в результатi опромiнення зумовленi дiсю радiацii переважно на юнi тiмоцити, без iстотного впливу на послi- дуючу диференцiацiю клiтин-попередникiв, що вижили, i дивергенцiю субпопуляцiй Звичайно вважають, що враження лiмфоiдних популяцiй тимусу с результатом виключно пошкоджуючоi дii iонiзуючого опромiнення як такого.В той же час с багато доказiв стресорного ефекту опромiнен- ня i можливостi спустошення тимусу i розвитку лiмфопенii в резуль- татi пiдвищення сироваточного рiвня кортикостероiдiв, зумовленого стресом. М.П.Савiна та А.А.Ярилiн 1994 провели дослiдження, в якому намагалися виявити, чи впливас на клiтиннiсть тимусу локальне оп- ромiнення гiпоталамуса, гонад, селезiнки та стегна. Експеримент проведено на мишах. Доза радiацii варiювала вiд 1 до 10
Гр. Аналiз проводився через 1 добу, 1, 3 та 12 мiсяцiв пiсля опромiнення.Вия- вилося,що при локальному опромiненнi будб-якого органу клiтиннiсть тимусу знижувалася. Проте,термiни нормалiзацii числа тiмоцитiв бу- ли рiзними. При опромiненнi стегна та cелезiнки рiвень Т-клiтин вiдновлювався через добу гонад – до кiнця першого року. При опро- мiненнi самого тимусу 10 Гр зниження рiвня тiмоцитiв вiдмiчало- ся на протязi всього
перiоду спостережень. Вченi роблять висновок, що в формуваннi пiзнього Т-клiтинного дефiциту вiдiграс роль не лише опромiнення тимусу, але й стабiльнi ендокриннi порушення пiс- ля опромiнення гiпоталамуса та гонад але не селезiнки та стегна . При локальному радiацiйному впливi на тимус 1 10 Гр , гiпотала- мус, гонади, селезiнку та стегно 10 Гр раннс спустошення тимусу може бути викликане як безпосередньою дiсю опромiнення на орган, так i пiдвищенням
рiвня гормонiв – медiаторiв стресовоi реакцii при дii радiацii на iншi органи Деякi автори вважають, що iонiзуюче опромiнення в малих до- зах може здiйснювати стимулюючий вплив на органiзм iз збiльшенням маси тiла, середньоi тривалостi життя, пiдвищенням стiйкостi до рiзних несприятливих впливiв i iнфекцiй завдяки активацii iмунних реакцiй. Хоча пов язанi з цим дослiдження проводилися на тваринах, клiтиннi механiзми згаданих ефектiв до цього часу практично не ви- вченi. Н.А.Слiсесва зi спiвавторами 1994 дослiдили механiзми стимулюючоi дii малих доз опромiнення на iмунiтет, зокрема, на бласттрансформацiю лiмфоцитiв кровi пацюкiв по критерiю включення Н-тимiдину в ДНК. Причому перевiряли як самостiйний вплив опромi- нення, так i його ефект на фонi стимуляцii мiтогеном. В якостi мi- тогену брали Конканавалiн А. Мiтоген вносили в культуру за 10 хв до опромiнення.
Дози варiювали вiд 1 до 6 сГр. Дослiдники вiдмiти- ли велику рiзноманiтнiсть чутливостi тварин до мiтогену в залеж- ностi вiд цього iх роздiлили на 3 групи . Можливо, причина цього – рiзноманiтнiсть у початковому вмiстi лiмфобластiв у кровi рiзних тварин та в рiзнiй початковiй чутливостi рецепторiв лiмфоцитiв до мiтогену. Результати дослiджень показали вiдсутнiсть стимуляцii лiмфоiдноi пролiферацii при опромiненнi без мiтогену
i посилення бласттрансформацii при опромiненнi в дозах 0,09-6 сГр на фонi Кон А при сумарнiй дозi 12 сГр рiвень знижувався до контролю . Тобто, опромiнення само по собi не с стимулятором пролiферацii лi- мфоцитiв кровi, але в сполученнi з мiтогеном здатна посилювати йо- го стимулюючий вплив на клiтини iмунноi системи I.М.Бiляков зi спiвавторами висунув думку про iснування сти- мулюючих доз , при яких в культурi з являюься
ростовi фактори Т-клiтин. Вони провели дослiдження впливу -опромiнення у новона- роджених мишей на пролiферативну активнiсть камбiального епiтелiю в культурi стромальних клiтин тимусу. Виявилося, що опромiнення в момент висiву культури послаблюс пролiферацiю клiтин в логарифмiч- нiй фазi росту. Пiсля 2 дiб культурування опромiнення в дозах 10 i 20 Гр подавляло пролiферацiю ендотелiальних клiтин ЕК тимусу.Але доза 15 Гр викликала посилення пролiферативноi активностi. Якщо оцiнка результатiв проводилася через 48 годин культурування а не через 24, як у першому випадку посилення пролiферацii спостерiга- лося при дозах 5, 8 i 15 Гр. При 10 Гр – iнгiбiцiя, пiсля 20 Гр – послаблення пролiферацii. Вченi припускають,що стимулюючi дози змiнюють iнтенсивнiсть мiжклiтинних контактiв
ЕК з iншими клiтинами строми тимусу. Цей обмiн проходить повiльно, тому наслiдки пошкоджень можуть прояви- тися на рiвнi цiлого органiзму вiдносно пiзно. В кiнцевому резуль- татi цi пошкоджуючi ефекти радiацii на ЕК тимусу повиннi вiдобра- зитися на вмiстi в стромi тимусу епiтелiальних клiтин, iх функцiо- нальнiй активностi, ефективностi процесу розвитку Т-лiмфоцитiв. Очевидно, наслiдками саме таких змiн с заресстрованi прояви
Т-клi- тинного iмунодефiциту у осiб, що зазнали впливу факторiв аварii на ЧАЕС через 5 рокiв пiсля iх дii. Взагалi, дослiдження Бiлякова показали,що ефект радiацii про- являсться в посиленнi подiлу Т-клiтин, якi без опромiнення перехо- дять в стан спокою, тобто стають бiльш зрiлими, функцiонуючими клiтинами 1.5 ДIЯ IОНIЗУЮЧОГО ВИПРОМIНЮВАННЯ НА ОРГАНIЗМ
ЛЮДИНИ. Р.В.Петров зi спiвавт. 1994 вiдмiчають, що для iмунноi сис- теми характерна висока мобiльнiсть, пов язана з тим, що всi ii го- ловнi компоненти практично завжди знаходяться в активованому робо- чому станi i певний рiвень активацii, мабуть, с нормальним станом iмунноi системи. Пiд впливом антигенних та неантигенних проявiв якими може виступати iонiзуюча радiацiя , що безперервно поступа- ють у внутрiшнс середовище органiзму, iмунна система постiйно змi- нюс свiй облiк, рiвнi своiх
складових частин Т-хелперiв, Т-супре- сорiв, Т-контрсупресорiв i т.д При виникненнi реакцii на зов- нiшнiй вплив iмунна система буде збурена до того часу, доки не перейде в новий рiвноважний стан. Цей стан зберiгасться до того ча- су,доки iнший стимул не поступить зовнi або не виникне в органiзмi. Якщо антигеннi стимули проникають в органiзм неперервно, очевидно, iмунна система безперервно буде змiнюватися i знаходитися в русi. У свiтлi концепцii iмунологiчних мобiлiв по новому виникас питан- ня про нормативнi параметри iмунноi системи. Наприклад, пiдви- щення рiвня клiтин-хелперiв ще нiчого не означас, коли не вистачас макрофагiв. Навпаки, мале число помiчникiв може бути iдеальним,ко- ли немас супресорiв Першi ж дослiдження стану iмуноi системи у людей, що приймали участь у лiквiдацii наслiдкiв аварii на ЧАЕС продемонстрували пору- шення в клiтиннiй ланцi iмунiтету.
Вмiст Т-загальних лiмфоцитiв був знижений, Т-активних – пiдвищений. Зниження кiлькостi Т-лiмфо- цитiв спостерiгалося у 57 обстежених, пiдвищення числа Т-активних – у 75 обстежених.Враховуючи вiдмiнностi в дозi опромiнення осiб, що працювали в 1986 i 1987 рр було проаналiзовано матерiал у за- лежностi вiд часу перебування в Чорнобилi. Любченко П.Н. зi спiв- авторами 1990 встановили, що кiлькiсть
Т-клiтин у тих,хто працю- вав у Чорнобилi в 1986 i 1987 рр iстотно не вiдрiзнялася i була достовiрно нижчою, нiж у контролi. Кiлькiсть Т-клiтин, що активно утворювали розетки, у осiб, що працювали в 1987 роцi, була досто- вiрно нижчою, нiж у тих, що працювали в 1986 роцi, але перевищува- ла рiвень в контрольнiй групi Любченко вiдзначас, що хоча iс- нус думка про швидке вiдновлення складу лiмфоцитiв вже до кiнця другого мiсяця, с докази повiльного вiдновлення кiлькостi саме
Т- лiмфоцитiв. Його послiдуючi дослiдження показали, що у осiб, якi приймали участь у лiквiдацii наслiдкiв аварii на ЧАЕС i якi працю- вали в Чорнобилi в 1986 роцi, навiть через 5-5,5 рр. вiдмiчалися нерiзко вираженi, але стiйкi порушення клiтинного iмунiтету.Причо- му сильнiше страждас субпопуляцiя CD4 -хелперiв, формування яких залежить вiд тимусу, нiж CD8 -супресорiв В.С.Смiрнов зi спiвавт. 1990 проводили дослiдження населен- ня, яке зазнало впливу факторiв аварii на ЧАЕС через 2 роки пiсля катастрофи. У потерпiлих було виявлено iстотне пiдвищення вiднос- ного та абсолютного числа Т5 -лiмфоцитiв, в основному за рахунок Т8 -субпопуляцiй. Але достовiрне зниження вiдносного вмiсту Ea- РОК i пригнiчення лiмфокiноутворюючоi активностi Т-лiмфоцитiв свiд- чить про те, що функцiональна активнicть
Т3 -лiмфоцитiв була си- льно пригнiчена. Можливо, певну роль в депресii iмунних реакцiй вiдiгравали активованi Т-супресори. Таким чином, дослiдження стану iмунiтету у людей, що зазнали впливу радiацii в дозах 0,2-0,5 Гр пiд час аврii на ЧАЕС показали, що iмунологiчнi порушення, якi ви- никли при цьому, можуть зберiгатися протягом 2 рокiв пiсля опромi- нення. Було зроблено припущення, що нестабiльнiсть iмунного стату- су зумовлена порушеннями генетичного апарату
клiтини, що проявля- ються в конформацiйних змiнах ссДНК. Глибина зниження функцiональ- ноi активностi i змiн спiввiдношення субпопуляцiй лiмфоцитiв зна- ходиться у прямiй залежностi вiд ступеня деспiралiзацii ссДНК ра- дiацiйно обумовлена деспiралiзацiя ДНК лiмфоцитiв супроводжусться пригнiченням, а пiдвищена суперспiралiзацiя – нормалiзацiсю бiль- шостi реакцiй iмунноi системи Змiни у станi Т-клiтинного iмунiтету були виявленi не лише у лiквiдаторiв аварii
на ЧАЕС, але й у мешканцiв радiацiйно забруд- нених районiв. Так, О.Ф.Мельников зi спiавт. 1993 дослiлили стан iмунноi системи у мiстi Кисвi за першi 4 роки пiсля катастрофи. Проведенi дослiдження засвiдчили, що протягом першого року пiсля аварii найбiльш вираженi змiни визначалися з боку НЦК натуральних цитотоксичних клiтин та К-кiллерiв, якi вiдiграють важливу роль у реалiзацii протипухлинного та противiрусного iмунiтету. Функцiона- льна активнiсть цих клiтин була рiзко знижена. Значно менш вираже- ний характер мали змiни з боку Т-лiмфоцитiв периферичноi кровi об- стежених, котрi проявилися в основному тенденцiсю до зниження за- гального вмiсту Т-клiтин CD3 та вiдносного числа Т-ефекторiв CD4 -хелперiв , що призвело до загального зниження у них iндексу iмунореактивностi
CD4 CD8 . Виявлене в 1987 роцi значне зниження цитолiтичноi активностi НЦК продовжувало збiльшуватися в 1988 та 1989 рр у 1990 роцi рi- вень цитолiтичноi активностi К-кiллерiв периферичноi кровi обсте- жених значною мiрою вiдновився, тодi як функцiональна активнiсть НЦК зростала набагато повiльнiше, досягаючи в середньому 9,4 , що iстотно нижче контрольних значень. Триваюче пiдвищення рiвня акти- вностi К-клiтин у 1991 роцi, мабуть, можна розглядати як часткову компенсацiю
цитотоксичноi функцii, що певною мiрою не реалiзува- лася НЦК, функцiональна активнiсть яких мало змiнилася порiвняно з 1990 роком. Вмiст лiмфоцитiв периферичноi кровi до 1990 р. набли- зився до контрольного значення У випадку жителiв мiста Кисва можна говорити про вплив малих доз радiацii. Взагалi, згiдно iснуючих уявлень, малими вважаються дози iо- нiзуючого опромiнення, що переважають
природний радiацiйний фон ПРФ бiльше, нiж у 10 разiв. Вiдносно людини, така доза складас 0,04-0,05 Гр при тривалому опромiненнi. НКДАР ООН рекомендус вва- жати малими дози, що перевищують ПРФ у 10-100 разiв. Результати дослiджень впливу низьких рiвнiв iонiзуючого випромiнення на здо- ров я людей дозволяс визначити бiологiчну ефективнiсть всiх форм променевоi дii, починаючи з рiвнiв
ПРФ. При оцiнцi малих доз опро- мiнення МКРЗ при ООН виходить iз того, що будь-яка доза, вiдмiнна вiд нуля, с канцерогенною та генетично небезпечною. Як уже вiдмiчалося, одним iз наслiдкiв аварii на ЧАЕС с три- вале опромiнення населення малими дозами радiацii за рахунок про- никнення в органiзм радiоактивних речовин, що забруднюють продук- ти харчування. При цьому характерний повiльний розвиток патологi- чних процесiв Дослiдження, проведенi на пацюках i мишах, показали, що три- вале введення малих доз окису тритiю 180 дiб приводить до стiй- кого спустошення стволового кровотворного пула, яке зберiгасться до кiнця життя. Незворотне скорочення кiлькостi полiпотентних по- передникiв Т-клiтин вiдмiчалося i пiсля тривалого зовнiшнього – -опромiнення. Спостерiгалися значнi порушення Т-лiмфопоезу, не вiдновлювалися популяцii зрiлих, функцiонально-активних лiмфоци- тiв. Iмунодефiцитний стан формувався в результатi стiйкоi гiпопла- зii лiмфоiдноi тканини.
Причому гiпоплазiя тимусу та лiмфатичних вiддiлiв виражена сильнiше, нiж у селезiнцi i кiстковому моз- ку 2. МАТЕРIАЛИ I МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕННЯ. 2.1 ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСТЕЖЕНИХ ГРУП. Обстеження проводилися на практично здорових волонтерах, що навчаються в Черкаському державному унiверситетi на фа- культетах фiзвиховання та природничому факультетi. Показники клiтинного iмунiтету у практично здорових во- лонтерiв студентiв факультету фiзичного виховання
та студен- тiв природничого факультету розглядалися як контрольнi дослiдження. Для проведення iмунологiчних обстежень на кож- ного волонтера заповнюсться карта iндивiдуального обстежен- ня, розроблена в Республiканському центрi iмунологiчних дос- лiджень. В контрольну групу вiдбиралися волонтери-чоловiки, що вiдповiдали слiдуючим критерiям -вiсутнiсть професiйних шкiдливостей -вiдсутнiсть побутових шкiдливостей контакт з нiтрофарбами, гербiцидами, пестицидами -вiдсутнiсть
перенесених iнфекцiйних захворювань, травм, опiкiв -вiдсутнiсть в анемнезi хiмiкотерапii цитостатиками, гор- мональними препаратами, iмунодепресантами i iмуностимулято- рами та променевоi терапii -iмунологiчно не обтяжений сiмейний анемнез -вiдсутнiсть клiнiчних ознак iмунологiчноi недостачi -вiдсутнiсть хронiчних захворювань. Карта iндивiдуального iмунологiчного обстеження запов- нювалась в двух екземплярах один направлявся в Республiкан- ський центр iмунологii, другий залишався на кафедрi фiзiо- логii iз подальшим занотуванням на комп ютерi IВМ РС ХТ 286 в iмунологiчнiй лабораторii. До дослiдних груп належали студенти факультету фiзично- го виховання та студенти природничого факультету, котрi заз- нали дii малих доз iонiзуючоi радiацii, проживаючи у зонiпо- ситленого радiацiйного контролю 4-та зона . До проведення iмунологiчного обстеження на пiддос- лiдних заповнювалися карти iндивiдуального iмунологiчного обстеження. Для проведення дослiдiв по змiнi показникiв клiтинного iмунiтету в периферичнiй
кровi обстеженню пiдлягали слiдуючi групи 1-ша група – практично здоровi волонтери, що навчаються на 4-му курсi факультету фiзвиховання ЧДУ 2-га група – практично здоровi волонтери, щонавчаються на 4-му курсi природничого факультету ЧДУ 3-тя група – особи, що проживають в зонi посиленого радiацiйного контролю та навчаються на 4-му курсi факультету фiзвиховання ЧДУ 4-та група – особи, що проживають в зонi посиленого радiацiйного контролю та навчаються на 4-му
курсi природничого факультету ЧДУ 2.2 МЕТОДИКА ВИЗНАЧЕННЯ СУБПОПУЛЯЦIЙ Т-ЛIМФОЦИТIВ У ВЕНОЗНIЙ КРОВI З ВИКОРИСТАННЯМ МОНОКЛОНАЛЬНИХ СИВОРОТОК Специфiчнi антитiла зв язуються з мембранними антигена- ми живих клiтин, що знаходяться у суспензii. Щоб запобiгти келiнгу i iндингу злущуванню антигенiв пiсля взасмодii з антитiлами, до суспензii клiтин добавляють 0.2 -й азид нат- рiю.
У прямих методах IФА використовують специфiчнi до клiтинних антигенiв антитiла, коньюгуючi з флуорисцентною мiткою. А маркування клiтин проводять як одноетапну реакцiю. У непрямих методах IФА в якостi антитiл використовують не мiченi антитiла до клiтинних антигенiв, а в якостi дру- гих – мiченi флуорохромом антитiла до iмуноглобулiнiв. Мар- кування клiтин проводять у два етапи. Другi антитiла служать для виявлення зв язаних з клiти- ною перших антитiл. Непрямi методи, як правило, чутливiшi прямих. 1. Венозну кров 7 мл з антикоагулянтом 9.8 цитрат нат- рiю 0.5 мл, або 25 од мл гепарина розбавлясмо фосфатним буфером у спiввiдношеннi 1 1. Склад фосфатного буферу КН РО 1,15 г. Na HPO 0,2 г. КСl 0,2 г. NaCl 8 г. на 1мл. дистильованоi води До фосфатного буферу додасмо 2 г. сироватки альбумiнiв кролика.
2. На свiжоприготовлений одноступеневий фiкол-верографiно- вий градiснт 2 мл. нашаровусмо за допомогою пiпетки з грушею розбавлену ФБ фосфатним буфером кров у центри- фужнiй пробiрцi. Методика виготовлення фiкол-верографiна. 24,4 г. фiколу-400 розчиняють у теплiй дистильованiй водi. Змiшують з 49,9 мл. 70 розчину верографiну. До- водять об см до 340 мл. Температура зберiгання розчину 8 С. 3. Пробiрки з градiснтом кровi центрифугусмо протягом 20-25 хв.
4. Вiдбирасмо пiпеткою з грушею середнiй опалесцуючий шар,що мiстить лiмфоцити у окремi пробiрки. 5. Вiдмивасмо популяцiю лiмфоциту вiд залишкiв градiснта фосфатним буфером двiчi, за допомогою центрифугування протягом 10 хв. Декантусмо. Вiдмивку повторюсмо 2 рази. 6. Доводимо концентрацiю мононуклеарних клiтин за допомо- гою розведення ФБ до рiвня 1-5 х 10 кл. мл. Контроль концентраццii проводимо вкамерi
Горясва в од- ному великому квадратi повинно мiститись 20 лiмфатич- них клiтин . 7. До 50 мкл одержаних клiтин добавлясмо мiкропiпеткою по 5 мкл. антисироватки LT3 – для визначення кiлькостi зрiлих Т-клiтин у венознiй кровi CD3 , LT1 – для зрiлих i майже зрiлих Т-лiмфоцитiв CD5 , LT4 – для визначення Т-хелперiв CD4 , LT8 – для визначення
Т-супресорiв CD8 . 8. Iнкубусмо сумiш лiмфоцитiв з антисиворотками протягом 20-25 хв при кiмнатнiй температурi. 9. Вiдмивасмо мононуклеари вiд залишкiв не зв язаноi АС. Для цього у кожну пробiрку доливасмо по 2 мл ФБ з кро- лячим альбумiном 2.5 i центрифугусмо протягом 10 хв. Вiдмивку повторюсмо двiчi. 10. До 50 мкл отриманоi сумiшi добавляемо по 5 мкл ФIТЦ. Iнкубусмо 20-25 хв. 11. Проводимо вiдмивку вiд флуоресцуючих антитiл мононук- леари. Вiдмивку проводимо аналогiчно вiдмивцi вiд анти- сивороток тричi. 12. Мононуклеари за допомогою пiпетки наносимо на предметне скельце. 13. Скельця помiщасмо на пiдставки у чашки Петрi з розчином формалiну i фiксус- мо препарат у його парах на протязi 10 хв. 14. Зафiксо- ваний препарат пiдсушують при кiмнатнiй темпера – турi.Готовi препарати зберiгаються у холодильнiй камерi протягом 3-х дiб.
15. Аналiз препаратiв. Пiдрахунок проводиться шляхом перерахунку флуоресцуючих клiтин на 100 клiтин проглянутих у препаратi. Мiкроскопують за допомогою мiкроскопу з люмiнiсцентною насадкою, окуляр-7, об сктив-90. У якостi iмерсii використовус- ться водний розчин глiцерину. 2.3. МЕТОДИКА ПIДРАХУНКУ ЧИСЛА ЛЕЙКОЦИТIВ В КРОВI 1. Палець протерти ватою змоченою 70 розчином спитту. 2.
Одноразовим стерильним скарифiкатором проколоти палець. 3. Першу краплю кровi зтерти ватою змоченою спиртом. 4. Декiлька крапель кровi з пальця витиснути на пред- метне скло. 5. Капiляром Салi 0,02 мл. кровi перенести в центри- фужну пробiрку з 0,4мл. 3 розчину оцтовоi кислоти. 6. Легким посту куванням по пробiрцi перемiшати вмiст i залишити пробiрку
для руйнування еритроцитiв. 7. Притерти покривне скло до камери Горясва таким чи- ном, щоб з явилися Ньютоновi кiльця. 8. Пiдрахувати кiлькiсть клiтин в 25 великих квадра- тах камери Горясва. 9. Одержаний результат перерахувати за формулою Х 10 20, де Х – кiлькiсть клiтин в 25 великих квадратах.
Нормальна кiлькiсть лейкоцитiв у дорослоi людини коливас- ться в межах 4500-10000 в 1 куб.мм. 2.4 МЕТОДИКА ВИЗНАЧЕННЯ ДИФЕНРЕНЦIЙОВАНОI ФОРМУЛИ ЛЕЙКОЦИТIВ. Визначення загальноi кiлькостi бiлих кров яних тiлець, дас уяву проiх абсолютну кiлькiсть. Але не дас вiдомостей про процентне спiввiдношення диференцiйовану формулу мiж рiзними видами лейкоцитiв i про якiснi змiни в iх морфологii при хворобливих станах. Визначення диференцiйованоi формули проводиться на фар- бованому мазку кровi. Диференцiйована формула характерно змiнгюсться при рядi хворобливих станiв i мас надзвичайно важливе дiагностичне i прогностичне значення. Нормальна диференцiйована формула дорослоi людини нас- тупна молодi нейтрофiльнi клiжтини – 0 паличкоядернi нейтрофiльнi клiтини – 0-4 сегментоядернi нейтрофiльнi клiтини – 55-70 лiмфоцити –
20-40 моноцити – 2-6 еозинофiльнi клiтини – 1-4 базофiльнi клiтини – 0-1 плазматичнi клiтини – 0-5 ВИГОТОВЛЕННЯ МАЗКА КРОВI. 1.Необхiдною умовою для правильного пiдрахунку морфо- логiчних особивостей кров яних клiтин являсться вда- лозроблений i добре забарвлений кров яний мазок. Добре зроблений мазок кровi повинен вiдповiдати наступ- ним умовам а починасться на 1 см. вiд вузького
краю предметного скла i закiнчусться на 2-3 см. вiд його другого краю. Загальна довжина мазка повинна охоплювати 1 2 – 3 4 скла. б мазок повине бути рiвномiрноi товщини, а не хвили- подiбний. Правельний мазок кровi товщий на початку, поступо- во тоншас i закiнчусться у виглядi слiду, мов би залишеного тонкою щiточкою. в мазок повинен бути вiдокремленим вiд краю. Шар кровi не повинен доходити до другогоь краю скла.
Приготування мазкiв проводиться слiдуючим чином пред- метне скло, на якому буде зроблено мазок, беруть за один кiнець великим i вказiвним пальцями правоi руки. Другий кiнець, вiдступаючи на 1 см. вiд краю, обережно дотикасться до свiжоiкраплi капiлярноi кровiiз пальця, нi в якому разi не торкаючись шкiри в мiсцi проколу. Крапля кровi перехо- дить на скло, вона повинна мати дiаметр 2-3 мм.
Предметне скло перекладають у лiву руку взявши його ве- ликим вказiвним i середнiм пальцямитак, щоб крапля знаходил ась зверху на предметному склi, з боку вказiвного i серед- нього пальцiв. Шлiфоване скло, яким буде зроблено мазок вставлясться пiд кутом 40-45 на 1-2 мм перд краплею, придержуючи великим i вказiвним пальцями правоi руки край шлiфованого скла i обидва краi предметного скла. Шлiфоване скло рухають назад так, щоб воно торкалося кровi i крапля поширювалася в кутi мiж шлiфованим i предметним склом. потiм швидким рухом ру- хаючи скло в зв оротньому напрямку роблять мазок. Протягом того часу коли робиться мазок, великий iвказiвний пальцi правоi руки ковзають по краях предметного скла i тим створюють необхiдну опору для накладання шару кровi. ФАРБУВАННЯ КРОВ ЯНОГО МАЗКА. Для якiсного дослiдження морфологii кров яних клiтин- фарбування кров яного мазка мас важливе значення. Основу су- часного фарбування кров яних клiтин поклав петербуржський
лiкар Д.Л.Романовсьий. В 1891 роцi вiн запропонував свiй барвник. В 1902 роцi Гiмза вдосконалив барвник Романовського. Барвник Романовського-Гiмза складасться з лужноi i кис- лоi частини. Лужна частина – азур 2, А кисла частина – еозин. Азур 2 забарвлений в яскраво-синiй колiр, а еозин в роже- во-червоний. Щоб приготувати основний розчин барвника розчиняють 30 г. азуру 2-еозину i 0,8г.
азуру 2 в 250 мл. глiцерину, наг- рiваючи прицьому 90-120 хв. при 50 С, а потiм додають 250мл. чистого метилового спирту. Пiсля вiдстоювання протягом 1-7 днiв при кiмнатнiй температурi фiльтрують. ФIКСАЦIЯ КРОВ ЯНОГО МАЗКА. Перед фарбуванням мазок кровi фiльтрують. Це робиться для денатурацii бiлкiв у клiтинах, при збереженнi iхжиттсвоi структури iж для закрiплення
клiтин на предметному склi. Для фiксацii використовусться абсолютний метиловий алкоголь. Час фiксацii – 3-5 хв. Перед роботою ,пiсля фiксацii, препарат заливають робо- чим розчином розведеним барвника Романовського-Гiмза. I залишають на 20-40 хв. Потiм його промивають, сушать, див- ляться пiд мiкроскопом. ПIДРАХУНОК ДИФЕРЕНЦIЙОВАНОI ФОРМУЛИ. Кров янi клiтини не розподiляються рiвномiрно повсьому препратi.
На початку i в кiнцi мазка вiдкладасться бiльшiсть великих клiтин з малою питомою вагою моноцити, гранулоцити , а в серединi – бiльшiсть малих клiтин, з вели- кою питомою вагою лiмфоцити . Порiвняно найбiльш правильне спiввiдношення складасться на дiлянках показаних на малюнку Тому саме на них проводиться диференцiйований пiдрахунок кров яних тiлець. Пiдрахунок робиться у виглядi меандрiв, щоб уникнути повторення одних i тих же клiтин. Пiдраховують не менше 25 клiтин краще по 100 в 4-х дiлянках вказаних на малюнку. РЕзультат виражають в . Замiсть 4-х малих меандрiв, можна без грубоi помилки, описати 2 великих меандри, тобто злити 2 малих поля вiдцен- тру з обох сторiн в одне велике, не роблячи розриву в сере- динi. В такому разi в кожному з обох великих полiв пiдрахо- вують мiнiмально по 50 клiтин краще по 100 i результат ви- ражають в . Для полегшення розрахункiв використовують еле- ментарнi механiчнi лiчильнi
машини. 2.5 ВИЗНАЧЕННЯ РIВНЯ CD3 ,CD4 ,CD5 ,CD8 ЛIМФОЦИТIВ У ПЕРИФЕРИЧНIЙ КРОВI. 1.Кров брали стерильно з лiктьовоi вени вранцi, до вжи- вання iжi. Лiмфоцити видiляли з гепаринiзованоi кровi цен- трифугуванням на градiснтi Фiкол-Вiрографiну густина 1,077 г мл . 2.1-0,1 млн. лiмфоцитiв в об смi 50 мкл. вносили в цен- трифужнi пробiрки i до клiтин додавали 5 мкл. моноклонально- го антитiла
CD8 i iнкубували 30-45 хв. при 4 С. 3.Додавали 150 мкл. розчину Хенкса i центрифугували 5 хв. при g 200. 4.Вилучали супернатант. Потiм вносили 50 мкл. розчину Хенкса, клiтини суспендували, додавали 150 мкл. розчину Хен- кса i центрифугували 5 хв. при g 200. 5.Вилучали супернатант. До осаду вiдмитих клiтин дода- вали 50 мкл. F ab 2-Фрагментiв овечих антитiл до
Ig мишi, помiчених ФIТЦ i розбавлиних 1 100. Для розведення викорис- товували фiзрозчин, забуферений фосфатом РВS , що мiстиь 0,5 желатину i 0,5 азиду натрiю. Клiтини суспензували i iнкубували 30 хв. при 4 С. 6.Клiтини 2 рази вiдмивали як указано в п.п.3-4. 7.Пiсля остаточного видалення супернатанту клiтини ви- носили на предметне скельце i помiщали в пари формалiну для фiксацii на 10-1 хв. Мiченi клiтини аналiзували з допомогою мiкроскопу з люмiнiсцентною насадкою ЛН-30МС. Статистичну обробку матерiалiв проводили звикористанням методики Андрю- щенко. 2.6 СТАТИСТИЧНА ОБРОБКА ДАНИХ Одержанi цифровi результати були обробленi методом варiацiйноi статистики по Стьюденту за допомогою програми складеноi аспiрантом кафедри алгебри Андрущенко. Оскiльки програма написана на мовi Ассемблер, то датиii ропечатку не- мас можливостi, а тому нижче наводиться, як приклад, ре- зультат обробки даних цiсю програмою.
Розрахунок основних характеристик вибiрки Показник cd 1. 2.0 2. 3.0 3. 7.0 4. 8.0 Середне арифметичне – 5.000 Дисперсiя – 75.111 Середне квадратичне вiдхилення – 2.944 Похибка середнього арифметичного – 1.472 Коефiцiент варiацii – 58.878 Коефiцiент асиметрii – 0.000 Ексцес – -0.417 Програма оброблялася на ПЕОМ IBM PC XT 286 3. СТАН
КЛIТИННОГО IМУНIТЕТУ У ПРАКТИЧНО ЗДОРОВИХ СТУДЕНТIВ ЧДУ. Нами проведене диференцiальне дослiдження показникiв клiтин- ного iмунiтету у студентiв 4 курсу факультетiв фiзвиховання та природничого факультету. Встановлено, що у практично здорових волонтерiв, що нав- чаються на 4-му курсi факультету фiзвиховання та природничому фа- культетi показники рiвня лейкоцитiв в периферичнiй кровi статис- тично достовiрно
не вiдрiзняються. Табл.1 . Табл.N1. Рiвень лейкоцитiв та лiмфоцитiв у практично здорових во- лонтерiв студентiв 4-го курсу природничого факультету та факультету фiзвиховання ЧДУ N п п Групи пiддослiдних Показники Лейко- Лiмфо- Лiмфо- статистич- ти цити цити ноi обробки x 10 л г л 1 Практично здоровi M 6,3 32,5 1,9 волонтери студенти б 1,27 12,4 0,2 факультету фiз- m 0,5 5,3 0,1 виховання
n 6 6 6 2 Практично здоровi M 6,7 24,5 1,5 волонтери студенти б 1,4 9,6 0,7 природничого m 0,6 3,8 0.1 факультету n 6 6 6 t 0,63 0,5 1,3 p 0,05 0,05 0,05 Прицьому вiдносна i абсолютна кiлькiсть лiмфоцитiв у пе- риферичнiй кровi обох груп знаходилась в межах вiковоi норми. Ми не спостерiгали статистично достовiрних рiзниць рiвня вiдносноi iабсолютноi кiлькостi лiмфоцитiв. Вiдомо, що лiмфоцити с гетерогенною популяцiсю. В ос- таннiй час субпопуляцii диференцiюють по експресii поверхне- вих маркерiв Взасмозв язок фенотипiчних i функцiональних варiацiй Т-клiтин реалiзусться через змiну iх рецепторного поля та експресii молекул, що приймають участь у виконаннi ефектор- ноi функцii клiтин Вiдомо, що для Т-клiтин характерна експресiя Т-клiтин- них рецепторiв. До таких рецепторiв вiдносяться поверхневi маркери
CD3 Експресiя поверхневого маркеру СD5 проявлясться на бiльш раннiх стадiях розвитку Т-клiтин. Вiдомо, що навiть претомоцити можуть мати такий фенотип CD7 2 1-38 4-8-3-ТКР- Таким чином поява у кровi лiмфоцитiв, що експресують по- верхневий маркер CD5, але не експресують СD3, свiдчать про появу в периферичнiй кровi менш зрiлих лiмфоцитiв. Про поя- ву в кровi менш зрiлоi субпопуляцii Т-клiтин ми судили по рiзницi мiж кiлькiстюлiмфоцитiв
СD3 та СD5 . Нами встановлене статистичнодостовiрне пiдвищення числа СD5 лiмфоцитiв у практично здорових волонтерiв, що нав- чаються на першому курсi факультету фiзичного виховання ЧДУ. Табл. N 2 . Табл. N 2. Експресiя СD3- i СD5- антигенiв на поверхнi лiмфоцитiв периферичноi кровi практично здорових волонтерiв студентiв 1-го та 4-го курсу факультету фiзичного виховання ЧДУ. N п п
Група пiддослiдних Показники СD3 СD 5 статис- T тичноi обробки г л г л 1 Практично здоровi M 62,3 1,2 65 1,3 волонтери студенти б 4,4 0,13 3,9 0,19 4-го курсу m 1,97 0,05 1,6 0,09 n 6 6 6 6 2 Практично здоровi M 63,8 1,05 69,6 1,1 волонтери студенти б 0,97 0,5 2,4 0,6 1-го курсу m 0,4 0,2 0,98 0,2 n 6 6 6 6 t 0,75 1 2,6 1,5 p 0,05 0,05 0,05 0,05 Встановлено вiдсутнiсть статистично достовiрноi рiзницi в експресii поверхневого маркеру
СD у практично здорових волонтерiв – студентiв 1-го та 4-го курсiв факультету фiзич- ного виховання. 4. СТАНКЛIТИННОГО МУНIТЕТУ У ОСIБ, ЩО ПРОЖИВАЮТЬ В ЗОНI ПОСИЛЕНОГО РАДIАЦIЙНОГО КОНТРОЛЮ. Дослiджувалися 2 групи осiб проживаючих у зонах посиле- ного радiацiйного контролю. 1-ша група-студенти 4-го курсу факультету фiзичного виховання, якi проживають у 4 зонi. Особливiстю цiсi групи с те, що з 1986 по 1992 рiк во- ни проживали в мiстах i селах черкаськоi областi, якi вiдно- сяться до зони посиленого радiацiйного контролю, а з 1992 по 1996 Р. в м. Черкаси. Але всi продукти харчування студенти привозили у 4-ту зону. Як вiдомо при дiленнi U тепловими нейтронами спостерiгасться вихiд Сs та Sr. При близьких перiодах напiврозпаду 28,2 – 30,2 р допустимий рiвень заб- руднення чорнозему буде перевищений в 20 разiв.
Зараз все частiше у зв язку з аварiсю на ЧАЕС проявляс- ться так званий вплив малих доз радiацii , що потрапляс в органiзм з iжею i водою. Головними iзотопами наявними в рос- линнiй i твармннiй iжi с Сs та Sr. Це -iзотопи, якi не рес- струються звичайними -лiчильниками. Вони накопичуються в кiстковiй тканинi i мають тенденцiю до наростання, т.т. у людини створюсться внутрiшнс джерело випромiнювання, яке ко- жен день активно травмус iмунну систему.
Тому студенти 4-го курсу навiть не проживаючи в зонi пiдвищеного радiацiйного контролю отримують свою дозу опромiнення зпродуктами приве- зеними з дому. Разом з тим цi студенти вiдчувають позитивний вплив оп- тима льних фiзичних навантажень. У зв,язку з вищевказаним стають зрозумiлими отриманiна- ми результати. Табл. N 3,4 . Табл. N 3. Рiвень лейкоцитiв та лiмфоцитiв у осiб, що проживють в зонi посиленого радiацiйного
кон- тролю i практично здорових волонтерiв сту- дентiв 4-го курсу факультету фiзичного ви- ховання ЧДУ. Nп п Групи пiддослiдних Показники Лейко- Лiмфо- Лiмфо- статистич- цити цити цити ноi оброб- х 10 л г л робки даних 1 Практично здоровi M 6,3 32,6 1,9 волонтери студенти б 1,27 12,7 0,3 4-го курсу m 0,5 5,2 0,1 n 6 6 6 2 Особи,що прожива- M 5,9 34,6 2,1 ють в зонi пiдви- б 2,0 4,9 0,6 щеного радiацiйно- m 0,9 2,1 0,3 го
контролю сту- n 5 5 5 денти 4-го курсу t 0,44 0,4 0,3 p 0,05 0,05 0,05 Табл. N 4 Експресiя CD3 i CD5 -антигенiв на поверхнi лiмфоцитiв периферичноi кровi практично здоро- вих волонтерiв студентiв 4-го курсу факультету фiзичного виховання та iх однокурсникiв, що проживають в зонi посиленого радiацiйного кон- тролю. N п п Групи пiддослiдних Показники CD 3 CD 5 статистич- T T ноi оброб- г л г л ки даних 1 Практично здоровi M 62,3 1,2 65 1,3 волонтери студенти б 4,84 0,13 3,9 0,19 4-го курсу факуль- m 1,97 0,05 1,6 0,08 тету фiзвиховання n 6 6 6 6 2 Особи, що прожива- M 59,8 1,2 63,2 1,2 ють в зонi посиле- б 9,6 0,4 5,2 0,4 ного радiацiйного m 4,2 0,2 2,3 0,2 контролю, студенти n 5 5 5 5 4-го курсу факуль- тету фiзвиховання t 1,2 0,1 0,6 0,5 p 0,05 0,05 0,05 0,05 Дослiди переконують в тому, що у студентiв 4-го курсу фа- культету фiзвиховання, що зазнали хронiчного впливу фак- торiв аварii на
ЧАЕС не постерiгасться статистично дос- товiрних змiн показникiв клiтинного iмунiтету. В другiй серii експериментiв дослiджувався стан клiтин- ного iмунiтету у студентiв 4-го курсу природничого факульте- ту, що також зазнали впливу малих доз радiацii. Встановлено,що в цих студентiв iснус рiзниця мiж зрiвнювани- ми середнiми варiацiйних рядiв iпрактично здорових однокур- сникiв по показниках вiдносноi кiлькостi
CD3 та CD5 лiмфо- цитiв Табл.N 5 . Однак патологiчнаiонiзуючого випромiнювання може посилю- ватись iншими патологiчними факторами. Так в якостi цих фак- торiв може виступати емоцiйний стрес обумовлений наявнiстю важких теоретичних дисциплiн бiохiмiя,фiзiологiя,рiзно- манiтнi зазалiки та екзамени. Томму ми проаналiзували стан лiтинного iмунiтету у студентiвприродничого факультету, що проживають у 4 зонi з практично здоровими волонтерами, якi невiдчувають хронiчних стресових впливiв.
Нами встановлено, що дiя малих доз радiацii посилюсться екстримальними i емоцiйними навантаженнями. Феноменпрояв- лясться у зниженнiабсолютноiкiлькостi лiмфоцитiв в перифе- ричнiй кровi, а таккож у зниженнi абсолютноi кiлькостi клiтин, що експресують на своiй поверхнi клiтини рецептори CD3 , CD5 . Табл.N6,7 . Табл.N5. Експресiя CD3 I CD5 – антигенiвна поверхнi лiмфо- цитiв периферичноi кровi практично здорових волонтерiв студентiв природничого факультету та iх однокурсникiв, що проживають в зонi посилено- го радiацiйного контролю. N п п Групи пiддослiдних Показники CD 3 CD 5 статистич- T T ноi оброб- г л г л ки даних 1 Практично здоровi M 63,8 1,05 69,6 1,14 волонтери,студенти б 0,97 0,5 2,4 0,6 4-го курсу природ- m 0,4 0,2 0,98 0,2 ничого факультету n 6 6 6 6 2 Особи,що прожива- M 50,1 0,6 58,2 0,7 в зонiпосиленого б 6,03 0,14 4,96 0,15 радiацiйного конт- m 1,6 0,03 1,3 0,03 ролю, студенти 4 n 14 14 14 14 курсу природничого факультету
t 8,6 2,25 7,1 1,5 p 0,001 0,05 0,001 0,05 Табл.N6. Рiвень лейкоцитiв та лiмфоцитiв у практично здорових волонтерiв студентiв 4-го курсу при- родничого факультету, та студентiв природничго факультету, що проживають у 4-й зонi. Nп п Групи пiддослiдних Показники Лейко- Лiмфо- Лiмфо- статистич- цити цити цити ноi оброб- х 10 л г л робки даних 1 Практично здоровi M 6,3 32,6 1,9 волонтери, студен- б 1,27 12,7 0,3 ти 4-го курсу
m 0,5 5,2 0,1 n 6 6 6 2 Особи, що прожива- M 5,5 22,2 1,2 ють у 4-й зонi, б 1,4 4,9 0,3 студенти 4-го курсу m 0,4 1,3 0,07 n 14 14 1,4 t 1,25 1,94 5,83 p 0,05 0,05 0,001 Табл.N 7. Експроесiя CD3 i CD5-антигенiв на поверхнi лiмфоцитiв периферичноi кровi у практично здо- рових волонтерiв студентiв 4-го курсу та осiб, що проживають у 4-й зонi студентiв 4-го курсу природничого факультету . N п п Групи пiддослiдних Показники CD 3
CD 5 статистич- T T ноi оброб- г л г л ки даних 1 Практично здоровi M 62,3 1,2 65 1,3 волонтери,студенти б 4,84 0,13 3,9 0,19 4-го курсу факуль- m 1,97 0,05 1,6 0,08 тету фiзвиховання n 6 6 6 6 2 Особи, що прожива- M 50,1 0,6 58,2 0,7 в зонiпосиленого б 6,03 0,14 4,96 0,15 радiацiйного конт- m 1,6 0,03 1,3 0,03 ролю, студенти 4 n 14 14 14 14 курсу природничого факультету t 4,8 10,34 3,3 7,05 p 0,01 0,001 0,01 0,001 Встановлено, що через 7-9 рокiв пiсля аварii на ЧАЕС у осiб евакуйованих з 1-i радiацiйноi зони, спостерiгасться тенденцiя до зниження кiлькостi лейкоцитiв в периферичнiй кровi, в той час як рiвень лейкоцитiв у мешканцiв-i зони ма- ло вiдрiзнясться вiд контролю. Спостерiгасться абсолютне пiджвищення числа лiмфоцитiв у обох групах пiддослiдних. Але присубпопуляцiйному аналiзi масмо таку картину. Встановлено статистичну достовiронiсть зниження числа клiтин, щоекспресують
CD3-пан-Т-клiтинний маркер у осiб, що проживають у 4-й радiацiйнiй зонi. Через рецепторний ком- плекс CD3 TKR реалiзусться класичний шлях активацii Т-лiмфо- цитiв, тому зниження числа клiтин акцепторiв активацii CD3 може свiдчити про враження даного шляху iмунноi вiдповiдi. У осiб, що проживають в четвертiй радiацiйнiй зонi на вiдмiну вiд евакуйованих з 30 км. зони спостерiгасться
дос- товiрне зниження кiлькостi клiтин з фенотипом CD4,тобто клiтин-хелперiв. Достовiрноi залежностi мiж експресiсю CD8 антигену та дозами опромiнювання не виявлено. Зниження експресii CD4-поверхневого маркера лiмфоцита- ми при дii малих доз радiацii може бути проявом радiацiйно- го старiння iмунноi системи. Спiввiдношення CD4 CD8 iму- норегуляторний iндекс с важливим показником iмунноi системи.
I порушення iмуннорегуляторного iндексу на користь клiтин-супресорiв, при тривалiй дii малих доз може привести до вторинних iмунодефiцитних станiв, вiдмiни протипухлинно- го та противiрусного iмунiтету. Табл.8,9 . Таблиця N 8. Рiвень лейкоцитiв i лiмфоцитiв в перифе- ричнiй кровi особин, що були пiдверженi дii iонiзуючого випромiнювання в рiзних режимах. Групи дослiджуваних ПОКАЗНИКИ Лейкоцити Лiмфоцити х10 л 1. Контроль n 13 6,2 0,41 28,0 0,94 1,70 0,137 2. Особини,що ева- 5,4 0,50 35,0 2,64 1,80 0,118 куйованi з 1-i радiацiйноi зони n 12 3. Особини, що про- 6,3 0,32 24,0 1,36 1,52 0,120 живають в 4-Й радiацiйнiй зонi n 27 t 1-2 1,23 2,50 0,55 t 1-3 0,076 1,68 0,99 Таблиця 9. Експресiя Т-клiтинних маркерiв лiмфоцитами у особин, що були пiдверженi впливу iонiзуючоi радiацii в рiзних режимах. Групи ПОКАЗНИК И дослiджуваних T T особин CD4 -л iмфоцити
CD8 -лiмфоцити CD4 CD8 10 л 10 л Контроль n 13 41,0 1,4 0,69 0,06 30,0 1,7 0,51 0,59 1,40 0,08 Особини, що 34,0 1,8 0,65 0,03 27,0 1,1 0,47 0,40 1,30 0,06 евакуйованi з 1-i рад. зони n 12 Особини, що 34,0 1,1 0,51 0,04 28,0 0,9 0,41 0,03 1,24 0,09 проживають в 4-Й рад. зонi n 27 t 1-2 3,68 0,60 1,65 0,56 0,98 t 1-3 3,78 2,43 0,99 1,52 1,23 t 2-3 1,22 2,72 0,89 1,23 0,53 ВИСНОВКИ 1. РiвеньCD3 ,CD4 ,CD5 ,CD8 -лiмфоцитiв у практично здорових осiб, що мешкають на черкащинi
знахо- диться на рiвнi показникiв жителiв iнших районiв Украiни. 2. У студентiв, що зазнали впливу малих доз радiацii спостерiгасться порушення у регуляторнiй ланцi iмунiтету, що спостерiгасться у зниженнi iмуноре- гуляторного iндексу CD4 CD8 . 3. Малi дози iонiзуючого випромiнювання впливають на стан клiтинного iмунiтету, що проявлясться в зни- женнi абсолютноi i вiдносноi кiлькостi зрiлих
Т-лiмфоцитiв експресують поверхневий маркер CD3 . 4. Дозоване фiзичне навантаження викликас стабiлiзацiю показникiв Т-клiтинного iмунiтету у осiб, що зазнали впливу малих доз радiацii. ЛIТЕРАТУРА 1. Анохин Ю.Н Норец Т.А Белоусова А.В. Стимуляция вос- становления иммунологической реактивности у мышей пос- ле облучения
Иммунол 1989 N 1 c.44-46. 2. Баева Е.В. Влияние трийодтиронина на синтез нуклеино- вых кислот иммуноцитами в культуре клеток Проблемы эндокринологии 1989 N 1 с. 79-83. 3. Беляков И.М Кузьменюк О.И Ярилина А.А. Влияние -из- лучения на пролиферативную активность камбиального эпи- телия в культуре стромальних клеток тимуса Радиобио- лог 1993 Т.33 Вып.2 с.214-218. 4. Борисова А.М Сетдикова Н.Х Пинегин Б.В. Клинико-им- мунологическая эффективность применения оксиметацила у больных с вторичным иммунодефицитным состоянием Имму- нол 1994 N 6 с.48-50. 5. Действие ионизирующей радиации на организм человека Под ред. Е.П. Кронкайте и др Медгиз 1960 с.8-9, 15-149. 6. Добровинская О.Р Шапошникова В.В Корестов Ю.Н. и др.
Влияние агентов, ингибирующие процессы киллинга на интерфазную гибель облученных тимоцитов Иммунол 1989 N 6 с.33-35. 7. Елисеева Н.А Левитман М.Х Корыстов Ю.Н. и др. Влия- ние малых доз облучения на бланстрансфрмацию лимфоци- тов крови крыс Иммунол 1994 N 1 с.28-30. 8. Иммунология В 3-х т. Т.1. Пер. с англ. У.Пола М. Мир, 1987-1989 с.26-31, 93-111, 306-312. 9.
Итоги науки и техники. Иммунология. 1992 Т.23 с.5-8. 10. Капитоненко А.М Дочкин И.И. Клинический анализ лабо- раторных исследований М Воениздат 1988. 11. Кирилова Е.Н Мурзитна А.Д Муксинова К.Н.Клеточные основы иммунодефицитного состояния в отдаленном перио- де после хронического радиационного воздействия Иммунол 1989 N 1 с.32-33. 12. Климарская
Н.Н Левицина Г.М Шалькова Г.А. Радиоак- тивные изотопы и иммунитет М. Энергоиздат 1969. 13. Коляда Т.I Волянський Ю.Л Васiльев М.В. Проблема виявлення прихованих форм вторинних iмунодефiцитiв та бiологiчнi наслiдки Чорнобильськоi аварii Укр.радiол. Ж 1995 N 1 с.44-47. 14. Любченко П.Н Юрина Т.Н Креславская Е.Е. и др. Сос- тояние иммунной системы у людей, учавствовавших в
лик- видации последствий аварии на Чернобыльской АЭС Имму нол 1990 N 6 с. 60-62. 15. Любченко П.Н Юрина Т.Н Дубинина Е.Б. и др. Динами- ка некоторых показателей иммунитета у мужчин, учавство- вавших в ликвидации последствий аварии на Черно- быльской АЭС в 1986 и 1987 гг. Иммунол 1994 N 3 с. 53-55. 16. Мельников О.Ф Самбур М.Б Розенфельд Л.Г. Динамiка стану эмунноi системи у мешканцiв Киева пiсля аварii на Чорнобильськiй АЕС Укр. Радiол. Ж 1993 N 2 с. 81-84. 17. Ноздрачев А.Д. Общий курс физиологии человека и живот- ных М. Высшая школа Т.2 1991. 18. Пастер В.И Овод В.К Вихоть Н.Е. Иммунологя практи- кум . К. Выща школа 1989 с.302. 19.
Петров Р.В. Иммунология. М. Медицина 1983. 20. Петров Р.В Хаитов Р.М Пинегин Б.В. Оценка иммунно- го статуса человека в норме и при патологии Иммунол 1994 N 6 с. 6-9. 21. Савина М.П Ярилин А.А. Поражение тимуса ипопуляции Т- лимфоцитов в ранние и отдаленные сроки после локально- го облучения лимфоидных иэндокринных органов Имму- нол 1994 N 4 с.
39-43 22. Сарыбаева Д.В Захарова Л.А Михайлова А.А. Актива- ция неспециических Т-клеток-супрессоров в условиях ба- рокамерной гипоксии Иммунол 1990 N 1 с.66-68. 23. Смоляр В.И. Ионизирующая радиация и питание. -К. Здо- ровья 1992 с.94-119. 24. Смирнов В.С Ващенко В.И Морозов В.Г. Состояниеимун- ной системы у людей через 2 года послевоздействия фак- торов радиационной
аварии Иммунол 1990 N 6 с. 63-65. 25. Смирнова В.П. Математическое моделирование радиацион- ных воздей на систему иммунитета Иммунол 1984 N 2 с.38-42. 26. Ткачева Г.А Балаболкин М.И Ларичева И.П. Радиоимму- нологические методы исследования справочник . -М. Ме- дицина 1983. с.192. 27. Хансон К.П Комар В.Е.
Молеулярные механизмы радиа- ционной гибели клеток М. Медицина 1985. 28. Харченко Т.Ю Ярилин А.А Мирошниченко И.В и др. Влияние пренатального облучения на развитие тимуса и селезенки мышей Иммунол 1994 N 3 с.15-18. 29. Шубик В.М. Проблемы экологичесской иммунологии. М. Ме- дицина 1976. 30. Ярилин А.А Панчук В.Г Гриневич Ю.А. Структура тиму- са и дифференцировка Т-лимфоцитов. К. Наукова думка 1991. 31. Ярилин А.А. Роль дифференцировки и модификации в форми- ровании разнообразия Т-лимфоцитов Проблемы и пер- спективы современной иммунологии. Метод. анализ 1988 с. 234-247. 32. Ярошинская А.А. Чернобыль с нами М. Книга 1991 с. 100-103. 33. Nakamura
N Kusinoki Y Akiyama M. Radiosensitiviti of CD4 or CD8 Positive Humane N-limphocytes by an In Vitro Colony Formation assay Rad. Res 1990 V. 123 P. 224-227. .FRM .MAC – В