Введение
Глутаминовая кислота (α-аминоглутаровая) является одной из важнейшихаминокислот растительных и животных белков. Не относится к числу незаменимых,однако, тем не менее, служит основой для синтеза многих физиологически активныхсоединений, необходимых для нормальной жизнедеятельности человеческогоорганизма. Она обладает очень приятными органолептическими свойствами и потомуимеет широкое применение в различных областях.
Важной особенностью глутаминовой кислоты является способностьслужить защитным фактором при различных отравлениях печени и почек, усиливатьфармакологическое действие одних и ослаблять токсичность других лечебныхсредств, поддерживать наряду с другими аминокислотами постоянную реакцию среды.На этих свойствах и основано лечение ряда заболеваний путем введения в организмглутаминовой кислоты.
Не меньшее значение имеет и мононатриевая соль этой аминокислоты –глутамат натрия. Это соединение усиливает вкус многих пищевых продуктов, атакже способствует длительному сохранению вкусовых качеств консервированныхпродуктов. Это обстоятельство позволяет широко использовать моноглутамат натрияв консервной промышленности, особенно при консервировании овощей, рыбы, мясныхпродуктов. Во многих зарубежных странах глутамат натрия добавляют абсолютно вовсе продукты при консервировании, замораживании или просто при хранении. ВЯпонии, США и других странах глутамат натрия является такой же обязательнойпринадлежностью стола, как соль, перец, горчица и другие приправы. Он повышаетне только вкусовую ценность пищевых продуктов, но и стимулирует деятельностьпищеварительных желез. В настоящее время производство глутаминовой кислоты стало очень крупным.Ведущее место в этом производстве занимают Япония и США. [1]
1. Характеристика конечной продукции производства
По показателям, определяемым органолептически, техническая L-глутаминовая кислотадолжна соответствовать требованиям, указанным в таблице 1.
Таблица 1 Показатели, определяемые органолептически Наименование показателей Характеристика Внешний вид Кристаллическая масса коричневого цвета Вкус Кислый специфический Запах Специфический Растворимость Легко растворима в разбавленных кислотах, щелочах и горячей воде, трудно растворима в холодной воде и концентрированной соляной кислоте, почти нерастворима в этиловом спирте, эфире и ацетоне
По химическим показателям техническая L-глутаминовая кислотадолжна соответствовать требованиям, указанным в таблице 2
Таблица 2. Химические показателиНаименование показателей Нормы Массовая доля влаги, %, не более 22,0 Массовая доля L-глутаминовой кислоты (в пересчете на сухое вещество), %, не менее 75,0 Массовая доля хлоридов (СГ) (в пересчете на сухое вещество), %, не более 10,0
В соответствии с требованиями МРТУ 18/210–68 глутамат натрияпищевой должен иметь следующий состав (в%):
– Основное вещество, неменее – 94;
– Хлорид натрия, не более –5;
– Влага, не более – 1;
– Общий азот, не менее – 7,02.
2. Химическая схема производства
Известно несколько способов получения глутаминовой кислоты:гидролиз различных белков, синтез химический, ферментативный из α-кетоглутаровойкислоты и микробиологический.
2.1 Получение глутаминовой кислоты гидролизом белков
Гидролиз протеинов является классическим методом полученияаминокислот из природных источников. Для выработки глутаминовой кислоты и еенатриевой соли используются животные и растительные белки: казеин молока,клейковина пшеницы, кукурузный глютен, отходы мясокомбинатов, свеклосахарных(сепарационный щелок) и спиртовых заводов (барда).
Метод гидролиза малопроизводителен и довольно дорог из-зазначительного образования побочных продуктов и необходимости тщательной очисткиглутаминовой кислоты.
Комплексная переработка мелассы позволяет получить наряду свысококачественными сахарными сиропами глутаминовую кислоту, бетаин, холин идругие ценные продукты. [1]
2.2 Химический синтез глутаминовой кислоты
Среди методов химического синтеза наиболее перспективным являетсяиспользование в качестве исходного сырья акрилонитрила. Согласно этому методу акрилонитрил врезультате реакции гидроформилирования превращается в β-формилпропионнитрили последний через стадию образования α-аминоглутардинитрила переводится в DL-глутаминовую кислоту.
Основным недостатком химического синтеза является получениерацематов аминокислот. Разделение D- и L-изомеров является довольно сложной операцией итребует больших затрат. [1]
2.3 Ферментативный синтез глутаминовой кислоты
Его возможно осуществить из α-кетоглутаровой кислоты с помощью ферментовтрансамилазы или глутаматдегидрогеназы в результате следующих превращений.
В каждом из этих процессов α-кетоглутаровая кислота играет рольпредшественника. Для осуществления любого из этих превращений необходимыисточники α-кетоглутаровой кислоты и соответствующей ферментной системе.Первую из этих задач решают с помощью подбора микроорганизмов, способныхпродуцировать значительное количество α-кетоглутаровой кислоты из дступныхисточников сырья. Продуцентами α-кетоглутаровой кислоты могут быть Psedomonas и Esherichia, а при культивированиипродуцента Kluyverdcitrophilaα-кетоглутароваякислота была получена с 57%-ным выходом. Дрожжи рода Candidaпри выращивании нан-парафинах продуцируют α-кетоглутаровую кислоту совместно спировиноградной в соотношении 6:1. Экономический коэффициент процессабиосинтеза достигает 90% от количества потребленных углеводородов.
В роли продуцента фермента трансамидазы могут выступать различныемикроорганизмы, например Е. coll. Донором аминогрупп может быть аспарагиноваякислота или аланин.
Восстановительное аминирование возможно осуществить с помощью Pseudomonas(при использовании Ps. ovalisвыход L-глутаминовой кислотысоставляет 60%) или Aeromonas, причем некоторые штаммы этих микроорганизмов вкачестве субстрата могут использовать D, L,-α-оксиглутаровую кислоту, производимую химическимсинтезом.
2.4 Микробиологический синтез глутаминовой кислоты
Наиболее перспективным и широко используемым способом производстваглутаминовой кислоты является микробиологический синтез. Впервые овозможностиполучения L-глутаминовойкислоты непосредственно из углеводов с помощью микроорганизмов методомглубинного культивирования сообщили в 1957 г. Японские ученые Киносита,Асаи и др.
К настоящему времени выяснено, что способностью продуцироватьглутаминовую кислоту обладают некоторые расы дрожжей, микроскопические грибы,бактерии. Однако практически только бактерии могут синтезировать глутаминовуюкислоту с выходом не менее 40% относительно исходного сахара или другого сырья.Поэтому промышленное значение имеют пока только бактерии, относящиеся к родам Micrococcus, Brevibacterium, Microbacterium, Corynebacterium.
Это, главным образом, палочковидные, грамположительные,неподвижные бактерии, не образующие спор. Специфической для них являетсяобязательная потребность в биотине либо в биотине и тиамине. Сырьем дляполучения глутаминовой кислоты кроме углеводов могут быть также различныеуглеводороды, начиная от природного газа (метан, этан) и кончая н-парафинамиили ароматическими соединениями (бензиловый спирт пирокатехин и пр.). Могутбыть также использованы газойль, уксусная, аминомасляная, фумаровая кислоты иряд других продуктов.
3. Технологическая схема производства
Имеет много общего со схемой производства лизина.Последовательность этапов и требования, предъявляемые к процессу в целом, оченьблизки. Основные различия заключаются в свойствах микроорганизма-продуцента,условиях его культивирования, составе среды, стадии очистки.
Схема получения глутаминовой кислоты при использовании в качествеисточников углерода глюкозы или гидролизата крахмала представлена ниже.
/>
Принципиальная технологическая схема получения глутаминовойкислоты или глутамата натрия складывается из следующих стадий: получениепосевного материала; приготовление питательной среды, ее стерилизация,охлаждение и засев готовым посевным материалом; выращивание продуцента вферментаторе до накопления максимального количества глутаминовой кислоты;выделение глутаминовой кислоты в кристаллическом виде или в виде кристалловглутамата натрия, сушка кристаллов, фасовка и упаковка.
4. Характеристика сырья материалов и полупродуктов
Состав питательной среды для главной ферментации и для полученияпосевного материала в значительной степени зависит от используемого продуцента,от его физиологических особенностей. Основным источником углерода в среде чащевсего используются глюкоза, сахароза, гидролизаты крахмала, свекловичнаямеласса, гидрол. Количество усваиваемого сахара в пересчете на сахарозу должнобыть в пределах от 8,5 до 25%. Но следует помнить, что пределы использованиямелассы определяются уровнем в ней биотина. Концентрация биотина, по даннымбольшинства исследователей, не должна превышать 2–5 мкг на 1 л питательнойсреды, иначе вместо глутаминовой кислоты будут интенсивно накапливаться аланин,молочная, янтарная, аспарагиновая кислоты, резко возрастет прирост биомассыпродуцента, но снизится выход глутаминовой кислоты. Иными словами, максимумбиосинтеза глутаминовой кислоты не совпадает с максимумом образования биомассы,так как потребность в биотине для этих двух процессов различна. Помимо мелассыбиотин в среду может быть внесен и с кукурузным экстрактом.
Ингибирующее влияние биотина удается снизить при включении всостав питательных сред различных добавок в виде некоторых спиртов, ПАВ,антибиотиков (пенициллинов, тетрациклинов). Вероятно, это связано с изменениемлипидного состава клеточных мембран, что способствует увеличению проницаемостиклеточных мембран для глутаминовой кислоты. Присутствие такого родастимуляторов позволяет вести ферментацию с большим выходом глутаминовой кислотыпри повышенных концентрациях биотина. Добавки в среду ПАВ в количестве 0,01–0,2%или калиевой соли бензилпенициллина повышают биосинтетическую способностьпродуцента на 15–45% и выход глутаминовой кислоты достигает 50г/л. [2]
В качестве источника азота в питательных средах чаще всегоиспользуют мочевину в количестве до 1,5–2,0% в зависимости от особенностейиспользуемого штамма, но вводится она дробно, по мере потребления ее из среды,и так, чтобы содержание ее в культуралыюй жидкости не превышало 0,8% и рН средыбыло в пределах от 6,8 до 7,8.
Недостаток азота в среде приводит к снижению синтеза глутаминовойкислоты и к накоплению в среде повышенных количеств α-кетоглутаровойкислоты.
Для нормального роста культуры и образования ею глутаминовойкислоты необходимо вводить в среду соли калия в виде КН2РО4до 0,1-/>
для поддержания рН среды на оптимальном уровне – около 7–7,2.Длительность культивирования зависит от содержания сухих веществ в среде,способа введения компонентов среды (единовременно или дробно), степени аэрациисреды и, конечно, от физиологических особенностей продуцента. [2]
5. Изложение технологического процесса
5.1 Приготовление питательной среды
Для промышленных штаммов Coryn. glutamicum питательные среды при производстве посевногоматериала, как правило, содержат следующие компоненты (в%) [2]:
Таблица 3Состав питательной среды (в%) Меласса 8 Кукурузный экстракт 0,3 Хлорид аммония 0,5 Калия фосфат двухзамещенный 0,05 Сульфат магния 0,03 Вода остальное рН среды 7,0–7,2
Питательные среды на стадии биосинтеза содержат те же компоненты ив том же количестве, только вместо кукурузного экстракта и сульфата аммонияприсутствует до 2% мочевины, содержание мелассы увеличивают до 20%,дополнительно вводят мел до 1% и 0,1% синтетического пеногасителя. [2]
5.2 Стерилизация питательной среды, аппаратов и коммуникаций
Подготовку ферментаторов (инокуляторов) к работе начинают спромывки использованного оборудования горячей и холодной водой с последующейобработкой аппаратов и коммуникаций острым паром. Стерилизацию питательных средосуществляют традиционным способом, так же как и подготовку технологическоговоздуха. Растворяемые компоненты среды нагревают до определенной температуры,затем выдерживают при этой температуре с последующим охлаждением до температурыферментации.
Питательная среда для выращивания продуцентов глутаминовой кислотысостоит из мелассы, кукурузного экстракта или другого источника ростовыхвеществ, мела и пеногасителя. Питательная среда готовится и стерилизуется в двестадии с учетом свойств компонентов, входящих в ее состав. Стадия подготовки истерилизация среды состоят из смешивания компонентов питательной среды вопределенной пропорции с помощью специальных дозаторов в реакторе, растворениясолей при перемешивании, нагрева до температуры стерилизации, выдержки при этойтемпературе в течение 1 часа и охлаждения до температуры, при которой проводитсякультивирование продуцента глутаминовой кислоты.
Термолабильные компоненты среды, например мелассу, содержащуюсахарозу стерилизуют отдельно. В реактор, снабженный мешалкой, подают мелассу инагревают ее при постоянном размешивании до температуры 80°С, с периодическимдобавлением к раствору определенного количества воды. Собственно стерилизациюосуществляют путем быстрого разогрева полученного раствора глухим паром до 120–122°Св специальном аппарате и выдерживают при этой температуре определенное время,необходимое для полной гибели всей микрофлоры. Охлажденный раствор сжатымстерильным воздухом передают в предварительно подготовленный ферментатор.Температура стерилизации мелассы выше, а длительность значительно меньше, чем те жепараметры при стерилизации остальных компонентов среды.
Пеногаситель, используемый на стадиях культивирования продуцента впосевном аппарате и основном ферментере, особенно в том случае, когда имявляется масло или жир, стерилизуется отдельно. Режимы стерилизации(температура и длительность) при обработке пеногасителя более жесткие, чем этопринято для стерилизации любых питательных сред.
Процесс получения глутаминовой кислоты требует строгихасептических условий, и поэтому особое внимание уделяется стерилизации нетолько среды, но и всех реакторов, коммуникаций, подаваемого воздуха.
При стерилизации аппаратуры режимы стерилизации зависят главнымобразом от материала, из которого изготовлено оборудование и его отдельныеузлы. Наибольшая эффективность стерилизации аппаратуры и коммуникацийнаблюдается при применении острого пара, имеющего температуру 135–140°С. Но отдельные блокиаппаратов, в том числе датчики измерительных приборов, не выдерживают такихусловий стерилизации, и потому в этих случаях могут применяться «холодные» способыстерилизации. Для такой обработки могут быть использованы бактерицидные газы(этилен) и растворы химических реагентов (формалина, смеси цитилпиридиновогобромида и этанолмеркурихлорида в соотношении 2:1, различные производные фенолаи их смеси, аммонийные соли первичных и вторичных алкилсульфатов,хлорсодержащие соединения, |3-пропиоллактон и т.д.).
Степень стерильности среды, оборудования и коммуникаций может бытьпроверена. Простерилизованную среду или смывы, произведенные стерильной водой свнутренних поверхностей аппаратов и трубопроводов, высевают на агаризованныеили жидкие питательные среды и инкубируют в термостате сутки. Если средыостаются стерильными, то стерилизация проведена качественно. Такой анализпроводится при пуске завода, в случае появления инфекции и периодически впрофилактических целях. [2]
5.3 Приготовление исходной и посевной культуры
Посевной материал на каждой из стадии его получения (от пробирокдо посевного аппарата) выращивают в строго асептических условиях по 24 ч.Состав питательных сред незначительно меняется при переходе от одного штамма кдругому и практически остается постоянным на каждой из промежуточных стадийполучения посевного материала. Только при выращивании продуцента в посевномаппарате в питательную среду вносят до 0,1% стерильного синтетическогопеногаситсля.
Накопление биомассы до 6–8 г. АСВ на 1 л среды производят ваэробных условиях сначала в инокуляторах объемом 2 м3, потом впосевных аппаратах объемом 5 м. Полученный посевной материал в количестве5–6% (от объема среды производственных аппаратов) стерильно передают в основныеферментаторы на 50 м3. Коэффициент заполнения аппарата 0,7. [2]
5.4 Выращивание продуцента в ферментаторе
Процесс биосинтеза осуществляют в строго асептических условиях вферментаторах объемом 50 м3 с коэффициентом заполнения аппарата0,7 в течение 48–52 ч и интенсивной аэрации [80–85 мг Ог/(л-мин)], чтосоответствует расходу 1 объема воздуха на 1 объем среды в 1 мин.Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной на уровне28–30°С. В конце процесса биосинтеза готовая культуральная жидкость содержит до45 г./л глутаминовой кислоты. Выход глутаминовой кислоты по отношению кпотребленным сахарам составляет 45–50%.
Поскольку производство глутаминовой кислоты направлено наполучение высокоочищенных препаратов, последующая технологическая схемапредусматривает производство продуктов, подготовленных непосредственно кприменению в качестве пищевых добавок и в виде лекарственных форм.
Выделение глутаминовой кислоты из культуральной жидкости ипоследующая очистка ее в соответствии с требованиями фармакопеи
предполагает такую последовательность проведения технологическихопераций. [2]
5.5 Предварительная обработка культуральной жидкости
Осуществляется в результате добавления к ней определенногоколичества негашеной извести (или известкового молока) с последующим осаждениемизбытка ионов кальция фосфорной кислотой. Образующийся при этом осадокспособствует лучшему отделению клеток продуцента и других балластных примесей.[2]5.6 Отделение биомассы от культуральной жидкости
Проводят центрифугированием или фильтрованием под давлением. [2]
5.7 Осветление фильтрата
Состоит в очистке его от пигментных примесей, окрашивающихнативный раствор в темный цвет. Для этого обрабатывают фильтрат активированнымуглем или подвергают его ионообменной сорбции на анионите ИА-1. [2]
5.8 Концентрирование осветленного раствора глутаминовой кислоты
Проводят путем его вакуум-выпаривания при температуре 40–60 °С,при этом из исходного раствора глутаминовой кислоты отгоняют от 50 до 80% воды.[2]
5.9 Осаждение кристаллов глутаминовой кислоты в изоэлектрической точке
Эта стадия осуществляется путем подкисления полученного напредыдущем этапе концентрата соляной кислотой до рН 3,2 (изоэлектрическая точкаглутаминовой кислоты) и охлаждения раствора до 4–15°С. Однократное проведениеоперации обеспечивает кристаллизацию 77% глутаминовой кислоты; при повторном еепроведении выход возрастает до 87%. Чистота получаемых кристаллов достигает 88%.
В результате последующей перекристаллизации чистоту получаемыхкристаллов можно увеличить до 99,6%, что удовлетворяет требованиям фармакопеи.[2]
5.10 Отделение кристаллов глутаминовой кислоты от маточника
Это достигается центрифугированием с последующей декантацией ивозвратом маточника на стадию вакуум-выпаривания. Полученные кристаллыпромывают обессоленной водой и направляют на сушку. [2]
5.11 Сушка кристаллов глутаминовой кислоты
Проводится в вакууме или в токе нагретого воздуха при 60-70°С. [2]
5.12 Получение глутамата натрия
Для получения глутамата натрия влажные кристаллы с содержанием 98–99%глутаминовой кислоты по сухой массе растворяют и нейтрализуют 45–50%-нымраствором NaOH до рН 6,8. Этот раствор концентрируют, и при охлаждении выпадаюткристаллы глутамата натрия, которые высушивают. Готовый препарат состоит на 98%из глутамата натрия. Выход готового продукта по глутаминовой кислоте поотношению к ее содержанию в исходной культуральной жидкости составляет 75–80%,максимально достигнутый выход не превышает 90%. [2]
6. Отходы производства и охрана окружающей среды
При производстве L-глутаминовой кислоты, в окружающую среду в составеконденсата и выбросов из ферментера попадают: бутиловый спирт, метилбутиловыйкетон, фенол, крезол, пиридин, циклогексиламин, изомасляная кислота,пропионовая кислота и другие вещества.
Технологические стоки и промывные воды, включающие клеткипродуцента, аминокислоты и другие компоненты культуральной жидкости, а такжеследовые количества глутаминовой кислоты, объединяют, упаривают и сушат снаполнителем до остаточной влажности 10%. Получают препарат, который используют каккормовой продукт, он содержит до 40% белковых веществ. [3]
7. Контроль производства
На биосинтез глутаминовой кислоты существенное влияние оказываютстепень аэрации среды, перемешивание, рН среды, длительность и температураферментации, возраст и доза посевного материала. Поэтому на всех стадияхпроцесса все параметры культивирования строго регламентируются и контролируются(температура, рН, изменение основных компонентов среды, накопление глутаминовойкислоты, аэрация, перемешивание и т.д.).
Уровень рН среды – это очень ответственный параметр процесса. Какизвестно, продуцентами являются бактериальные штаммы, и потому в большинствеслучаев оптимум рН для культивирования лежит в области, близкой к нейтральнойили слабощелочной. Для штаммов, используемых в нашей стране, наилучшиерезультаты по биосинтезу глутаминовой кислоты получаются, если рН средыподдерживается около 7–7,2. Для всех известных продуцентов глутаминовой кислотырН, обеспечивающей максимальное накопление глутаминовой кислоты и росткультуры, лежит в пределах от 6 до 8,5. [3]
Снабжение растущей культуры кислородом является ответственным иважным фактором, влияющим на рост микроорганизма и образование им лизина.Кислород, используемый бактериальной клеткой, должен быть растворен впитательной среде. Для увеличения растворимости кислорода осуществляютбарботирование среды воздухом с одновременным ее перемешиванием.
Контроль за ходом процесса биосинтеза осуществляют на разныхэтапах его проведения по оптической плотности раствора культуральной жидкости(по содержанию клеток продуцента), по содержанию субстрата в смеси или посигналам датчиков рН и растворенного кислорода в ферментационной среде. К концупроцесса биосинтеза содержание глутаминовой кислоты в культуральной жидкостидостигает не менее 45 г./л, концентрация оставшегося субстрата не более 0,5–1,0%.[1]