Механізм дії високого тиску і температури на деякі мікроорганізми та вітаміни

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені В.Н. КАРАЗІНА

НОГА Інна Володимирівна
УДК 577.3
МЕХАНІЗМ ДІЇ ВИСОКОГО ТИСКУ і ТЕМПЕРАТУРИ НА ДЕЯКІ МІКРООРГАНІЗМИ та ВІТАМІНИ

03.00.02 – біофізика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук
Харків – 2011
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Донецькому національному університеті Міністерства освіти і науки України.
Науковий керівник доктор фізико-математичних наук, професор Беспалова Світлана Володимирівна, Донецький національний університет, декан біологічного факультету, завідувач кафедри біофізики.
Офіційні опоненти: доктор фізико-математичних наук, професор Прилуцький Юрій Іванович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри фізики функціональних матеріалів,
доктор біологічних наук, професор Гордієнко Євген Олександрович, Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, професор кафедри біологічної і медичної фізики.
Захист відбудеться “_11”__червня__2008 року о _15___ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна, 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.
З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.
Автореферат розіслано “_6__”__травня_____2008 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
С.В. Гаташ
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останні роки дедалі більшу актуальність набуває проблема стерилізації продуктів харчування надвисоким тиском (100-800МПа), що обумовлено екологічною чистотою та малою енергоємністю даного методу. Перспективність цього способу обробки обумовлена тим, що при підвищенні тиску досягається асептичний ефект, а також у значній мірі прискорюються процеси, що ведуть до утворення якісно нових продуктів зі збереженням всіх живильних властивостей. Ця новітня технологія активно упроваджується в виробництво в ряді високорозвинених країн (Японія, Франція, Іспанія, США). З іншого боку, останнім часом високий тиск використовується для вивчення денатурації й ренатурації білків, що відкриває нові перспективи в дослідженні процесів метаболізму в живих організмах. На жаль, в Україні подібні дослідження та ця новітня технологія майже відсутні. Окремі епізодичні дослідження впливу надвисокого тиску на біосистеми проводилися в Донецькому фізико-технічному інституті НАН України (ДонФТІ) та в Донецькому державному університеті економіки та торгівлі ім. М. Туган-Барановського (ДонДУЕТ), де створена перша в Україні експериментальна установка для вивчення дії надвисокого тиску на продукти харчування з метою впровадження цієї технології у виробництво. Дані розробки стимулювали дослідження впливу високих тисків на біосистеми на кафедрі біофізики Донецького національного університету (ДонНУ), в межах НДР якої була виконана ця дисертація.
Біофізика процесів, що приводять до інактивації мікроорганізмів і зміни властивостей продуктів під високим тиском, залишається неясною. Оптимальні параметри тиску, температури та терміну обробки доводиться підбирати емпірично, що вимагає великих витрат ресурсів і часу. При цьому основною задачею є забезпечення стерильності обробленого продукту за умови збереження його харчосмакових якостей. Чимале значення має також економічна сторона процесу – витрати енергії й часу на обробку. Окрім того існує ще цілий ряд невирішених суто наукових питань, до яких належать з’ясування мікроскопічних механізмів дії тиску на різноманітні біооб’єкти, причини розходження в стійкості до тиску різних штамів одного виду бактерій, зміна структури оброблених тиском клітин та їхньої здатності до відновлення, а також дія тиску на внутрішньоклітинне рН.
Таким чином, актуальність теми дисертації зумовлена необхідністю наукового обґрунтування ефективних підходів в галузі створення фундаментальних основ нових технологій стерилізації високим тиском.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана за пріоритетним напрямом «Виробництво екологічно чистих продуктів та технології їх збереження», який рекомендовано в листі Міністерства освіти й науки України № 15/20-571 від 18.04.06 «Щодо пріоритетних напрямів для комплексних проектів». Робота виконана у рамках науково-дослідних держбюджетних тем кафедри біофізики ДонНУ «Вивчення механізму дії високого тиску й температури на деякі мікроорганізми й вітаміни» за договором про науково-технічне співробітництво між ДонНУ і ДонДУЕТ, № 44/25-75/03 від 15.12.2003 р. та ДонДУЕТ «Застосування енергетичних полів для розроблення нових і вдосконалення існуючих продуктів», № Держ. реєстрації 0103U001183, 2005 р.
Мета і завдання дослідження. Метою дослідження є експериментальне виявлення основних закономірностей та розробка фізико-математичних моделей спільної дії на біосистеми величини високого тиску і тривалості його дії, а також температури.
Для досягнення поставленої мети вирішувалися наступні задачі:
– експериментальне дослідження реакції мікроорганізмів і вітаміну С у різних середовищах на сполучену дію тиску і температури в залежності від тривалості дії цих факторів;
– фізико-математичне моделювання кінетики інактивації мікроорганізмів і процесу деградації вітаміну С;
– з’ясування фізичного механізму впливу тиску на функціональну збереженість біосистем;
– розробка рекомендацій з оптимізації і стандартизації алгоритму обробки харчових продуктів високим тиском.
Об’єкт дослідження – фізичні явища і процеси, що зумовлюють деградацію вітамінів й інактивацію мікроорганізмів у харчових продуктах і модельних біосистемах під дією тиску й температури.
Предмет дослідження – реакція біосистем на спільну дію тиску і температури в залежності від тривалості впливу цих факторів.
Методи дослідження – обробка біооб’єктів високим тиском при різних температурах і термінах витримки на експериментальних установках високого тиску, мікробіологічний аналіз, вимірювання кількості вітаміну С методом фотоелектроколориметрії, фізико-математичне моделювання кінетики деградації вітамінів та інактивації мікроорганізмів, чисельне моделювання.
Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше проведено комплексне експериментальне дослідження спільної дії тиску і температури на вітаміни та мікроорганізми.
Для оцінки сили впливу неврахованих факторів середовища вперше запропоновані й реалізовані експериментальні моделі, в яких харчове середовище імітується буферним розчином із заданим рН.
Розроблено оригінальну методику визначення оптимальних значень параметрів обробки досліджених груп мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів (МАФАМ), цвілі, вітаміну С та спор Bacillus subtilis й Bacillus stearothermophilus спільною дією підвищеного тиску і температури при різних термінах їхньої дії. У рамках цієї ж моделі описана кінетика температурної деградації вітаміну С, а також досліджено вплив нерівномірного остигання об’єкту дослідження. Спираючись на порівняння бар’єрів інактивації та дані щодо зміни об’єму різних мікроорганізмів, визначено фізичну причину впливу тиску на біосистеми.
На основі отриманих результатів у роботі розроблено новий фізично обґрунтований підхід до стандартизації процесу обробки харчових продуктів високим тиском, а також спосіб оптимізації параметрів обробки.
Практичне значення одержаних результатів. Результати виконаного дослідження можуть бути використані:
– у наукових дослідженнях у галузі баробіології для планування експериментів й оцінки термодинамічних параметрів, що описують зміни, які відбуваються в системі;
– у лабораторіях харчової промисловості для інтерполяції та інтерпретації розрізнених табличних даних по впливу тиску на окремі мікроорганізми, вітаміни й ферменти;
– у технології стерилізації продуктів харчування надвисокими тисками для оптимізації параметрів обробки з метою досягнення повної стерилізації при максимальному збереженні харчосмакових якостей продуктів та мінімальних витратах енергії й часу;
– для обгрунтування стандартів і норм стерилізації продуктів харчування надвисокими тисками.
Рекомендації і висновки дисертації можуть бути використані при розробці технологій обробки продуктів харчування високим тиском, а також у навчальному процесі на кафедрі біофізики ДонНУ.
Особистий внесок здобувача. У роботах [1, 3, 6, 9, 10, 12-16] – участь у плануванні, підготовці й проведенні експериментів, статистична обробка експериментальних даних, розрахунок параметрів кінетичної моделі; у [2, 8, 11-13] – опис кінетики інактивації мікроорганізмів; у [5, 15] – пояснення відхилення від лінійності нерівномірним остиганням зразка, оцінка величини ефекту, розрахунок виправлень до кривих залежності ступеня виживаності від тиску; у [6] – співставлення зростання кислотності харчових продуктів та дисоціації води під дією тиску та температури; у [7] – застосування кінетичної моделі для опису даних з інактивації спор, порівняння параметрів інактивації різних вегетативних форм мікроорганізмів та аналіз мікроскопічного механізму дії тиску. У всіх роботах – аналіз та інтерпретація результатів, підбір літератури.
Апробація результатів дисертації. Основні матеріали за темою дисертації повідомлені та обговорені на республіканських і міжнародних конференціях:
– І Українська наукова конференція «Проблеми біологічної й медичної фізики» (Харків, 2004),
– Міжнар. наук.-практична конф. «Грибівництво» (Донецьк, 2005),
– І міжгалуз. Міжнар. Конф. «Харчові добавки. Харчування здорової людини» (Донецьк, 2005),
– IV й VI Міжнар. наук. конф. асп. і студ. «Охорона навколишнього середовища й раціональне використання природних ресурсів» (Донецьк, 2005, 2007),
– IX Міжнар. конф. «Високі тиски – 2006» (Судак, 2006),
– IV з’їзд Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006),
– III Всеукраїнська науково-технічна конференція «Фізика. Біофізика – 2007» (Севастополь, 2007).
Публікації. За результатами досліджень, що увійшли до дисертації, опубліковано 16 наукових праць, у тому числі 7 статей у фахових журналах, 9 – тез доповідей на національних та міжнародних наукових конференціях і з’їздах.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, чотирьох розділів і висновків. Основний текст викладено на 131 сторінці машинописного друку. Дисертація містить 24 таблиці і 31 рисунок. Список використаних джерел містить 171 найменування. Робота має 1 додаток на 2 аркушах. Повний обсяг дисертації складає 151 сторінку.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обґрунтовано актуальність теми, сформульовано мету, задачі, об’єкт, предмет та методи дослідження, вказано зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами, наукову новизну і практичне значення отриманих результатів, особистий внесок здобувача, відомості про апробацію та публікацію результатів.
Розділ 1 присвячено огляду та аналізу літератури за темою дисертації, з

окрема опису нової технології стерилізації продуктів харчування надвисоким тиском, і
сторії її створення, перевагам. Як витікає з літературних даних, розвиток нової технології стримують невизначеність у виборі фізичних параметрів обробки і відсутність її стандартів.
Розглянуто особливості дії високого тиску на мікроорганізми, а також фактори, що впливають на стійкість бактерій до високого тиску (тип мікроорганізмів, умови їхнього росту й вік, кислотність середовища, склад харчових продуктів, температура). Літературні дані що до чутливості різних мікроорганізмів до дії тиску, як і до параметрів обробки харчових продуктів, що використовуються для інактивації мікроорганізмів, істотно різняться.
Крім того в огляді літератури розглянуто відомі механізми інактивації мікроорганізмів високим тиском, а також наведено дані про дію тиску на білки, зміну кислотності середовища під тиском, і її вплив на процес інактивації мікроорганізмів.
Огляд літератури свідчить, що дотепер немає єдиної теорії, яка б пояснювала все розмаїття явищ, що відбуваються в біологічних і хімічних матеріалах під дією високого тиску. Немає і сталих уявлень щодо механізму інактивації мікроорганізмів під дією тиску.
У розділі 2 описані матеріали і методи експериментального дослідження. Об’єктами, які зазнавали дію високого тиску, були зразки вишневого соку та яблучного пюре, а також вітамін С в буферних розчинах з рН від 4 до 6. Вимірювання проводилися у діапазоні тисків від 0 до 600МПа при температурах від 20 до 45°С. Тривалість дії тиску становила від 5 до 20 хвилин і здійснювалась на експериментальній установці високого тиску в ДонДУЕТ. Мікробіологічний аналіз зразків, що оброблялись високим тиском, та визначення концентрації вітаміну С виконувалися за методиками, що відповідають ДСТУ.
У розділі 3 наведені результати спільної дії тиску, температури й часу обробки на кількість виявлених мікроорганізмів і концентрацію вітаміну С у вишневому соку та яблучному пюре, а також результати модельних експериментів над чистим вітаміном С у розчинах різної кислотності.
Подано результати досліджень впливу тиску на мікробіологічні показники (інактивацію МАФАМ і цвілі) і вміст вітаміну С у вишневому соку.
Показано (рис.1), що тиск біля 500МПа є граничним для інактивації мікроорганізмів і цвілі. У той же час спад концентрації вітаміну С є незначним, (з ростом тиску від 300 до 500МПа він становить ~10% при t=10хв, T=25°C й ~50% при t=20хв, T=45°C).
Підвищення температури так само, як і збільшення тривалості дії тиску та температури приводить до суттєвого зменшення числа мікроорганізмів в інтервалі тисків від 300 до 500МПа. Зменшення концентрації вітаміну С при цьому однакові для зазначених тисків.
У роботі досліджено вплив високого тиску на зміст МАФАМ у яблучному пюре (Рис. 3), вивчено кількісний й якісний склад мікрофлори.
В модельних експериментах з обробки надвисоким тиском розчинів вітаміну С при різних кислотностях встановлено (Рис. 2), що вплив високого тиску на розчини з більшим рН приводить до більшої деградації вітаміну С. До такого ж ефекту веде збільшення часу обробки тиском. В розчинах з більшим рН спостерігається уповільнення швидкості падіння концентрації з ростом тиску.
Отримані результати що до впливу тиску, температури й часу витримки на деякі компоненти харчових продуктів узгоджуються з даними інших авторів і можуть бути використані для побудови феноменологічної моделі процесу обробки високим тиском.
У розділі 4

розглянуто фізичні основи явища деградації біосистем під
дією тиску. При порівнянні отриманих даних що до інактивації мікроорганізмів із відомими з літератури кривими денатурації білків під тиском виявлена кореляція між ступенем інактивації мікроорганізмів і ступенем денатурації білків, що свідчить на користь ключової ролі денатурації білків у механізмі інактивації мікроорганізмів.

Кінетику інактивації мікроорганізмів
і денатурації білків під дією сталих підвищеної температури й тиску можна розглядати як незворотну хімічну реакцію першого порядку. Зміна концентрації мікроорганізмів, що вижили, і не денатурованих білків в залежності від часу C(t) описується рівнянням розпаду:
, (1)
рішенням якого є: (2)

де – імовірність переходу біомолекули або мікроорганізму в пошкоджену форму в одиницю часу. У відповідності до теорії активованого комплексу, розглядаючи вказаний перехід як одновимірний процес активаційного типу, маємо:
, (3)

де W– висота енергетичного бар’єру, що відокремлює нативний та денатурований стани. Висота вказаного енергетичного бар’єру дорівнює мінімальній роботі, яка затрачується при переході з нативного стану на вершину енергетичного бар’єру, тобто:
, (4)

де Р0
і Т0
– температура і тиск у барокамері, ΔE, ΔS, ΔV– зміна енергії, ентропії та об’єму зразка.
При ΔV<0 вільна енергія реакції зменшується з ростом тиску, що відповідає зрушенню хімічної рівноваги убік збільшення кінцевого продукту у повній відповідності із принципом Ле-Шательє. Таким чином, зовнішній тиск P впливає на рівноважне співвідношення концентрацій у нативному N і денатурованому D станах через доданок Р0
ΔV у термодинамічному потенціалі, а також впливає на швидкість денатурації через зміну активаційного бар’єра (U + Р0
ΔV, де U= ΔE– Т0
ΔS).
Рішенням системи рівнянь (2)-(4) методом найменших квадратів винайдено набір {ln(A), U й ΔV}, при якому теоретичні криві щонайкраще проходять через всі експериментальні крапки. Цінність цього рішення полягає в тому, що за допомогою всього лише трьох параметрів описана реакція системи на будь-яке сполучення зовнішніх впливів тиску P, температури T й тривалості їхньої дії t. Непрямим підтвердженням правильності отриманих параметрів є близькість за порядком величини U та ΔV МАФАМ і цвілі до відомих значень для різних білків. Отримана зміна молярного об’єму ΔV для невеликої молекули вітаміну С по модулю на порядок менша, ніж характерні значення цього параметру для мікроорганізмів або для білків.
На Рис. 1 представлено криві, що розраховані з використанням винайдених параметрів, в порівнянні з експериментальними даними. Теорія цілком задовільно описує експеримент, зокрема, криві передають правильний хід концентрації залежно від тиску як для вітаміну С, так і для МАФАМ і цвілі, а також правильно відображають тенденції зміни цих залежностей при зростанні температури й часу обробки. У рамках однієї й тієї ж формули утворюються як плавно спадаючі майже лінійні залежності для вітаміну С, так і східчасті криві для МАФАМ і цвілі.
Тим самим проведені розрахунки, з одного боку, підтверджують правильність обраної моделі, а з іншого – дають можливість планувати експеримент і вибирати оптимальні значення параметрів обробки для максимальної стерилізації продуктів при найкращій збереженості вітаміну С.
Досліджено вплив високого тиску на кількість мікроорганізмів групи МАФАМ у яблучному пюре, тобто знайдені значення параметрів ln(A·1сек)=13.2, U=13.4ккал/моль та ΔV=-25.1мл/моль, які є близькими до значень відповідних величин, що отримані для вишневого соку. На Рис. 3 представлені експериментальні й теоретичні значення відносних чисел КУО МАФАМ (з двох серій дослідів T=30°С, t=20хв і T=25°С, t=10хв), отриманих для яблучного пюре, а також криві, що розраховані для вишневого соку у тих же умовах. Має місце цілком задовільна якісна згода теорії з експериментом. Крім того, в обох випадках наявне помітне зрушення убік менших тисків (приблизно на 150МПа) кривих для яблучного пюре порівняно з кривими для вишневого соку. Таке зрушення кривих убік менших тисків обумовлюється різними значеннями кислотності в яблучному пюре (pН=5.3) і у вишневому соку (pН=6.1). Як відомо, процеси денатурації білків й виживаність мікроорганізмів визначаються, насамперед, кислотністю середовища, швидкість інактивації мікроорганізмів тиском росте зі зниженням рН.
Для з’ясування, наскільки широким є клас об’єктів, для яких справедлива використана модель, та чи буде вона описувати відомі дані з інактивації мікроорганізмів, що отримані в роботах інших авторів, запропонований підхід було застосовано щодо даних з інактивації спор Bacillus subtilis і Bacillus stearothermophilus з робіт Urzica A.C., 2004 р. та Ardia A., 2004 р. Отримані таким чином значення термодинамічних параметрів наведені в Табл. 1. Для порівняння там же наведені знайдені нами параметри інактивації вегетативних форм мікроорганізмів.
Як видно, значення активаційного бар’єру U (Табл. 1) є близькими для всіх об’єктів. Крім того, ці значення потрапляють в інтервал від 10 до 20ккал/моль, характерний для активаційного бар’єру процесу денатурації різних білків. Отже, можна припустити що це є одна і та ж величина і що бар’єр інактивації U різних мікроорганізмів визначається процесом, що не пов’язаний з їхнім розміром, масою або формою.
Значення зміни питомого об’єму ΔV для всіх об’єктів (Табл. 1) за порядком величини збігаються з характерними значеннями ΔV для білків. Таким чином підтверджується припущення, що інактивація мікроорганізмів обумовлена деградацією білків. Величини ΔV для різних вегетативних форм приблизно однакові. Теж саме маємо і для спор, при цьому ΔV для спор помітно менше, ніж для вегетативних форм. Цей факт також підтверджує зв’язок інактивації мікроорганізмів з деградацією білків, оскільки в спорах упаковка білків є більш щільною і в них відсутні або є в мінімальній кількості порожнини, які заповнюються водою при розгортанні білка і дають вагомий внесок у зміну об’єму зразка.
Отримані в роботі експериментальні дані досить добре описуються в рамках кінетичної моделі першого порядку, одначе, в літературі часто зустрічаються дані зі значними відхиленнями від лінійності, які зазвичай описуються комбінацією двох реакцій першого порядку як двофазна кінетика з різними швидкостями інактивації. Зміна порядку реакції іноді спостерігається у межах одного виду бактерій і навіть у межах однієї серії дослідів, що зазвичай пояснюється існуванням невеликої частини популяції з підвищеним опором до впливу високого тиску, «багатофазністю» процесу інактивації або зміною порядку реакції. В дисертації показано, що цей ефект є пов’язаним з нерівномірним остиганням зразку, який нагрівається внаслідок стискання. При адіабатичному стисканні під тиском до 600МПа константа швидкості інактивації може збільшуватися для різних об’єктів від 2 до 5 разів у залежності від співвідношення W/kT.
Вирівнювання температури у зразку, що стискається, описується нестаціонарним рівнянням теплопровідності. Аналіз показує, що характерний час експоненціального остигання τ залежить від конструкції барокамери та не залежить від ступеню нагріву. Оцінка часу остигання
дає τ
~10хв, що влучає в область звичайних експозицій (від 5 до 30хв). Таким чином, при знятті кінетичної кривої дослідники неминуче охоплюють як область t < τ, так й t > τ. При t < τ температура біля середини зразка вища, ніж на периферії. При t > τ температура вирівнюється, середня по об’єму швидкість реакції падає, що й спостерігається як нова «фаза з підвищеною опірністю тиску». Можливість фіксації цієї фази у досліді залежить, насамперед, від величини зміни температури, яка визначається як величиною самого тиску, так і часом його зростання порівняно з τ.
Урахування нерівномірного остигання стиснутого зразка здійснювалось через усереднення по об’єму рішення лінійного кінетичного рівняння, в якому константа швидкості реакції визначається за формулою Ареніуса (3) з неоднорідним розподілом температури
,(5)

де – рішення нестаціонарного рівняння теплопровідності, безрозмірний розподіл температури в одиницях її максимального перевищення над початковою, що задається величиною адіабатичного нагрівання при стисненні βP (для води β=3ºC/100МПа). Початок відліку часу t=0 відповідає закінченню підвищення тиску.
При урахуванні нерівномірного остигання криві залежності ступеню деградації біооб’єктів від тиску (Рис. 1) змінюються незначно. Граничне значення тиску, при якому спостерігається різкий спад концентрації, зрушується в сторону менших тисків на 20 і 10МПа для t=10 й 20хв відповідно. З ростом часу обробки виправлення на нагрівання зменшується за рахунок зменшення середньої температури, при якій відбувається інактивація. Ґрунтуючись на отриманих результатах у роботі відкинуто сумнівні припущення, які робляться для пояснення особливостей кінетики цих процесів. З іншого боку, той факт, що лінійна кінетична модель здатна описати спостережувані на експерименті відхилення від лінійності є підтвердженням адекватності цієї моделі.
Розглянуто зростання кислотності під тиском як фактор інактивації мікроорганізмів. Аналіз літератури показує, що концентрація іонів водню визначає межі існування живої матерії. Багато експериментальних робіт доводять, що кислотність харчового середовища істотно впливає на ступінь інактивації мікроорганізмів високим тиском. Отримані і співставленні у даній роботі експериментальні і розрахункові криві для яблучного пюре і вишневого соку (Рис. 3) підтверджують факт росту швидкості інактивації мікроорганізмів під тиском за знижених рН. Величина зрушення збігається з літературними даними, згідно з якими кислотність харчових продуктів збільшується під дією тиску від 0.2 до 0.5 одиниць рН на кожні 100МПа. На відміну від мікроорганізмів вітамін С стабілізується при підвищенні кислотності середовища. Результати вимірів впливу тиску на зміст вітаміну С у середовищах різної кислотності (Рис. 2) показують, що більша деградація вітаміну С спостерігається у розчинах з більшим рН. Той же ефект дає збільшення часу обробки. Зростання кислотності харчових продуктів з підвищенням тиску пояснюється добре вивченим ростом дисоціації молекул води при підвищенні тиску й температури. В роботі показано, що збільшення тиску на 100МПа зменшує pH приблизно також, як збільшення температури на 10ºC. Таким чином збіг змін показника pH в інтервалах температури 60-100ºC та тиску 500-1000МПа, які стерилізують продукти харчування, не є випадковим і саме зміна pH з ростом як температури, так і тиску приводить до денатурації білків і, відповідно, до інактивації мікроорганізмів. Інактивуюча дія високого тиску зумовлена, в основному, зміною рН середовища, а інактивація клітини є вторинним ефектом.
Спираючись на отримані результати доведено, що механізмом впливу тиску на мікроорганізми є денатурація білків. Денатурація білків при нагріванні й втрата ними біологічної активності пов’язані з розривом сітки з молекул води, яка обмежує або стримує вібраційну динаміку білка. Необхідна для розриву енергія визначає розмір бар’єру U для переходу з нативного в активований стан N → A#
. Показником міцності сітки водневих зв’язків може служити кислотність середовища, оскільки, як доведено у роботі, вона впливає на швидкість інактивації. Величина рН знижується з ростом температури й тиску.
Вільна енергія реакції денатурації білка ΔGtotal
формується (див. Рис. 5(а)) спільними ефектами згортання/розгортання та зміни ступеня гідратації неполярних і полярних груп білка. Ці внески значною мірою компенсують один одного, так що вільна енергія стабілізації типового білка становить усього 10-20ккал/моль, тоді як зміни ентальпії ΔHnonpolar
й ΔHpolar
(і помножені на температуру зміни ентропії TΔSnonpolar
й TΔSpolar
) можуть розрізнятися більш, ніж на ±120ккал/моль. Там, де ΔGtotal
<0, спостерігається теплова (при T>T2
) і холодова (при T<T1
) денатурація, що у залежності від умов експерименту може протікати швидко або дуже повільно. Область існування нативного стану T1
<T<T2
визначає температурний оптимум щодо активності білка.
На Рис. 5(б) проілюстровано залежність стабільності білка від тиску. Область тисків вище деякого критичного значення P>Pc
відповідає денатурованому стану білка. Швидкість денатурації в цій області визначається величиною активаційного бар’єру, доданок U у якому пов’язаний з розривом сітки водневих зв’язків і є однаковим для термо- і бароденатурації. Вплив тиску на швидкість денатурації визначається сумарною зміною об’єму зразка. Область існування нативного стану P<Pc
відповідає оптимуму активності білка під тиском, Pc
є істотно меншим, ніж граничні значення інактивації (~500МПа для більшості мікроорганізмів).
Практичними наслідками дисертаційної роботи є можливості оптимізації параметрів стерилізації біооб’єктів та стандартизації
обробки високим тиском. Запропонована модель дозволяє передбачити поводження досліджених об’єктів при різних сполученнях параметрів обробки: тиску, температури і тривалості їхньої дії. Як приклад у роботі наведено ряд номограм, розрахованих для вибору параметрів впливу на вишневий сік, що зменшує в 106
разів концентрацію МАФАМ і цвілі. Показано, що для порівнянного зменшення концентрації вітаміну С величина тиску повинна бути на порядок вище. Номограми призначені для вибору тиску P і температури T при заданих термінах обробки t або для вибору тиску P і терміну обробки t при заданих температурах T.
Наразі відсутні загальноприйняті критерії, що визначають якість обробки тиском харчових продуктів. Ґрунтуючись на отриманих результатах, в дисертації запропоновано використовувати усереднені термодинамічні характеристики мікрофлори ln(A), U й ΔV як контрольні параметри при розробці процедури стандартизації обробки продуктів високим тиском.
ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі експериментально досліджено закономірності та розроблена фізико-математична модель спільної дії високого тиску і температури на мікроорганізми і вітамін С у різних середовищах, вивчено мікроскопічний механізм впливу тиску на біосистеми. Отримані результати можуть бути використані для подальшого розвитку баробіології та нової технології стерилізації харчових продуктів високим тиском.
Основні результати сформульовано наступним чином.
1. Показано, що основні закономірності спільної дії факторів високого тиску, температури й часу витримки на мікроорганізми й вітамін С відтворюються в рамках лінійної кінетики. При виборі параметрів обробки (тиску, температури і тривалості їхньої дії), а також при виробленні нових стандартів доцільно використовувати усереднені термодинамічні характеристики мікрофлори – передекспоненційний множник A, величину активаційного бар’єру реакції U та зміну об’єму ΔV.
2. Встановлено, що тиск порядку 500МПа є граничним для інактивації виявлених мікроорганізмів, у той час як вміст вітаміну С при цьому змінюється незначно – від 10% при T=25°C й t=10хв до 50% при T=45°C й t=20хв, що є значно меншим, ніж втрати вітаміну С у результаті теплової стерилізації, які становлять 80% при T=100°C і тривалості обробки 10 хвилин.
3. Показано, що відхилення кінетики інактивації мікроорганізмів від залежності, що є характерною для хімічної реакції першого порядку, пояснюється нерівномірністю остигання зразка, який нагрівається внаслідок стискання. Ці відхилення зростають з ростом величини тиску і швидкості його нагнітання. Залежність часу остигання від геометрії камери стиску пояснює розкид даних з різних лабораторій.
4. Зменшення граничного тиску для інактивації МАФАМ на 150МПа в яблучному пюре з pН=5.4 у порівнянні з вишневим соком з pН=6.1 пов’язано з впливом кислотності середовища на ступінь інактивації під тиском. Зростання кислотності середовища, що відбувається внаслідок підвищення тиску, прискорює інактивацію. Однакові для багатьох мікроорганізмів значення тиску ~500МПа (при 25°C) або температури ~60°C (при нульовому тиску), що є критичними для стерилізації, викликають однакове зниження pН і відповідають виходу біосистеми за межі кислотного оптимуму.
5. Збіг винайдених значень активаційного бар’єру U для всіх досліджених мікроорганізмів доводить, що інактивація визначається процесом, який не є пов’язаним з їхнім розміром, масою або формою. Близькість значень зміни питомого об’єму ΔV до характерних значень ΔV для білків підтверджує обумовленість інактивації мікроорганізмів деградацією білків.
6. Механізм впливу тиску на мікроорганізми визначається конкуренцією внесків у вільну енергію денатурації від розгортання полярних і неполярних груп внутрішньої частини білкової глобули. Утворення активованого стану пов’язане з відкриттям доступу води у внутрішні порожнини білка.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Шаталов В.М., Нога И.В., Сукманов В.А., Петрова Ю.Н., Соколов С.А., Жданов И.В., Волкова А.В. Оптимизация параметров обработки продуктов питания сверхвысоким давлением // Проблемы экологии и охраны природы техногенного региона: Межведомственный сборник научных работ. – Донецк, 2003. – N.3. – C.238-247.
2. Нога И.В., Шаталов В.М., Сукманов В.А. Кинетика деградации биомолекул под действием высокого давления и температуры // Физика и техника высоких давлений. – 2004. – T.14, N.2. – C.74-85.
3. Борисенко И.Н., Ветрова Е.В., Нога И.В., Панфилова Е.Г., Шаталов В.М. Инактивация микроорганизмов в яблочном пюре под действием высокого давления // Вісник Донецького університету, сер. А: Природничі науки. – 2006. – N 2. – С.375-377.
4. Нога И.В. Термодинамика воздействия высокого давления и температуры на микроорганизмы и витамины // Физика и техника высоких давлений. –2006. – T.16, N.3. – C.126-136.
5. Нога И.В., Шаталов В.М. Причины нелинейности в кинетике инактивации микроорганизмов под давлением // Біофізичний вістнік. – 2007. – Вип. 18 (1). – С. 90-95.
6. Нога И.В., Шаталов В.М. Рост кислотности среды под давлением как фактор инактивации микроорганизмов // Физика и техника высоких давлений. –2007. – T.17, N.2. – C.131-137.
7. Нога И.В., Шаталов В.М. Моделирование кинетики инактивации спор Bacillussubtilis и Bacillusstearothermophilus // Біофізичний вістнік. – 2007.– Вип. 19 (2). – С. 116-121.
8. Нога И.В., Шаталов В.М., Сукманов В.А. Моделирование воздействия давления и температуры в процессах стерилизации продуктов питания сверхвысоким давлением // Прoблеми бiологiчної і медичної фізики: І Українська наукова конференція з міжнародним представництвом. Xapків, 20-23 верес. 2004 р. – Xapків, 2004. –C.197-197.
9. Шаталов В.М., Нога И.В., Волкова А.В., Сукманов В.А. Сохранение витамина С в процессах пастеризации продуктов питания сверхвысоким давлением // Харчові добавки. Харчування здорової людини: І міжгалуз. Міжнар. Конф. Донецьк, 8-9 квіт. 2005р. – Донецьк, 2005. – С.249-251.
10. Волкова А.В., Нога И.В. Сохранение витамина С в процессах пастеризации продуктов питания сверхвысоким давлением // Охорона навколишнього середовища та раціональне використання природних ресурсів: Міжнар. наук. конф. асп. та студ.Донецьк, 12-14 квіт. 2005 р. – Донецьк, 2005. – Т.2. – С.174-175.
11. Нога И.В., Шаталов В.М. Стерилизация сверхвысоким давлением // Достижения, проблемы и перспективы культивирования грибов. Современные технологии: Междунар. науч.-практ. конф. Донецк 29 сент.-2 окт. 2005г. – Донецк, 2005. – C.55-58.
12. Беспалова С.В., Нога И.В., Сукманов В.А., Шаталов В.М. Изучение действия высокого давления и температуры на некоторые микроорганизмы и витамины // Матеріали IV з’їзду українського біофізичного товариства Донецьк, 19 – 21 грудня 2006 р. – Донецьк, 2006. – С.331-332.
13. Нога И.В., Шаталов В.М. Термодинамический анализ деградации биосистем под действием высокого давления и температуры // Высокие давления – 2006: 9-я междунар. конф. Судак, 17-22 сент. 2006 г. – Донецк, 2006. – С.152.
14. Нога И.В., Шаталов В.М. Изменение pH под давлением как фактор инактивации микроорганизмов // Матеріали IV з’їзду українського біофізичного товариства Донецьк, 19-21 грудня 2006 р. – Донецьк, 2006. – С.354-355.
15. Нога И.В., Шаталов В.М. Изучение механизма действия высокого давления и температуры на некоторые микроорганизмы и витамины //Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики. «Физика. Биофизика – 2007»: ІІІ Всеукраин. науч.-техн. конф. г. Севастополь, 23-28 апр. 2007 г. – Севастополь, 2007. – С.135-137.
16. Борисенко И.Н., Нога И.В., Панфилова Е.Г. Действие высокого давления на микроорганизмы в яблочном пюре // Охорона навколишнього середовища та рацiональне використання природних ресурсов:VI Міжнар. наук. конф. асп. та студ. Донецьк, 17-19 квiт. 2007р. – Донецьк, 2007. – С.160-161.
АНОТАЦІЯ

Нога І.В. Механізм дії високого тиску і температури на деякі мікроорганізми та вітаміни. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, Харків, 2008.
Робота присвячена науковому обґрунтуванню створення фундаментальних основ нової технології стерилізації продуктів харчування високим тиском. Із цією метою досліджені механізми інактивації мікроорганізмів і деградації вітамінів під дією тиску (до 600МПа) і температури (до 60°С). Методи– експериментальне дослідження та фізико-математичне моделювання кінетики деградації вітамінів і інактивації мікроорганізмів під дією тиску, температури й інших факторів. Показано, що тиск ~500МПа є граничним для інактивації більшості мікроорганізмів, у той час як зміст вітаміну С змінюється незначно. Кінетика інактивації мікроорганізмів і деградації біомолекул цілком задовільно відтворюється в рамках хімічної реакції першого порядку. Високий тиск та підвищена температура збільшують кислотність середовища. Зрушення кислотності обумовлює денатурацію білків, що, в остаточному підсумку, приводить до інактивації мікроорганізмів. Мікроскопічний механізм впливу тиску на мікроорганізми визначається відкриттям доступу води у внутрішні порожнини білків. Результати роботи можуть бути використані при виборі оптимальних параметрів обробки продуктів високим тиском для забезпечення стерильності продукту й збереження його харчосмакових якостей з мінімальними витратами енергії й часу, а також для розробки відсутніх на даний момент стандартів у технології обробки продуктів харчування надвисоким тиском.
Ключові слова: високий тиск, кінетика, інактивація, мікроорганізми, денатурація, білки.
SUMMARY

Noga I.V. Mechanism of the high pressure and temperature impact on some microorganisms and vitamins. – Manuscript.
Thesis for a candidate degree of physical and mathematical sciences by specialty 03.00.02 – biophysics. – Kharkiv National University, Kharkiv, 2008.
The work is devoted to creation of a fundamental base of technology of sterilization of food by the high-pressure treatment. With this purpose microorganism inactivation mechanisms and degradation of vitamins under action of pressure (up to 600МПа) and temperatures (up to 60°С) are researched. Methods of research – experimental supervision and mathematical modeling of degradations of vitamins and microorganism inactivation kinetics under action of pressure, temperatures and other factors. It is shown, that pressure ~500MPa is boundary for inactivation of the majority of microorganisms while the content of vitamin C thus varies slightly. Microorganism inactivation kinetics and degradation of biomolecules it is quite well described within the first order chemical reaction. The high pressure and temperature increase the acidity. The shift of acidity causes protein denaturation that, finally, leads to inactivation of microorganisms. The microscopic mechanism of influence of pressure upon microorganisms is determined by opening of access of water in internal cavities of proteins. Results of work can be used to optimize the set of parameters of the high pressure processing of products which give maintenance of sterility of a product and preserve its flavor qualities with the minimal expenses of energy and time, and also for development of the high pressure processing technology standards which are absent at the present time.
Keywords: high pressure, inactivation, kinetics, microorganisms, unfolding, protein.
АННОТАЦИЯ

Нога И.В. Механизм действия высокого давления и температуры на некоторые микроорганизмы и витамины. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, Харьков, 2008.
Работа посвящена научному обоснованию создания фундаментальных основ технологии стерилизации продуктов питания высоким давлением. С этой целью исследуются механизмы инактивации микроорганизмов и деградации витаминов под действием давления и температуры.
Цель работы – экспериментально выявить основные закономерности и разработать физико-математические модели совместного действии на биосистемы факторов высокого давления, температуры и времени выдержки. Методы исследования – экспериментальное исследование и физико-математическое моделирование кинетики деградации витаминов и инактивации микроорганизмов под действием давления и температуры.
В работе предполагается, что при высоких давлениях и температурах возникают некоторые первичные нарушения на молекулярном и межмолекулярном уровнях, которые индуцируют последующие изменения и регулируются общими термодинамическими соотношениями. Кинетика этих процессов описывается феноменологически с учетом таких термодинамических параметров, как активационный барьер реакций, изменение молярного объема и т.п. Процессы, приводящие к первичным нарушениям, подчиняются общим термодинамическим законам, поскольку охватывают огромное число межмолекулярных столкновений. Такое рассмотрение проблемы обработки пищевых продуктов сверхвысокими давлениями на основе биофизических подходов является новым.
В процессе решения задачи поиска общих характеристик, описывающих воздействие давления, температуры и времени обработки на различные составные части пищевых продуктов – витамины, микроорганизмы и пр., впервые проведено комплексное экспериментальное исследование. Для отделения неучтенных эффектов среды впервые была предложена и реализована концепция модельных экспериментов, в которых пищевая среда имитируется буферным раствором с заданным рН. Впервые действие давления, температуры и времени выдержки на обрабатываемые продукты объединены в рамках одной модели. Разработана методика определения параметров этой модели. В рамках той же модели получено описание кинетики деградации витамина С. Впервые предлагается микроскопический механизм воздействия давления на микроорганизмы, основанный на сравнении барьеров инактивации и изменений молярного объема для различных микроорганизмов. На основе полученных результатов в работе разработан новый физически обоснованный подход к стандартизации процесса обработки продуктов высоким давлением, а также способ оптимизации параметров обработки. Созданы научные предпосылки для разработки приоритетного направления «Производство экологически чистых продуктов и технологии их хранения».
Выводы. Давление ~500 МПа является граничным для инактивации большинства микроорганизмов, в то время как содержание витамина С при этом меняется незначительно. Кинетика инактивации микроорганизмов и деградации биомолекул вполне удовлетворительно воспроизводится в рамках химической реакции первого порядка. Высокое давление и повышенная температура увеличивают кислотность среды. Сдвиг кислотности обуславливает денатурацию белков, что, в конечном итоге, приводит к инактивации микроорганизмов. Микроскопический механизм воздействия давления на микроорганизмы определяется открытием доступа воды во внутренние полости белков.
Результаты работы могут быть использованы при выборе оптимальных параметров обработки продуктов высоким давлением для обеспечения стерильности продукта и сохранения его пищевкусовых качеств с минимальными затратами энергии и времени, а также для разработки отсутствующих на данный момент стандартов в технологии обработки продуктов питания сверхвысоким давлением.
Ключевые слова: высокое давление, инактивация, кинетика, микроорганизмы, денатурация, белки.