Содержание
Введение. 2
Из истории открытия С-белков. 8
Структура и свойства. 8
Связь с мембраной. 9
Стуктурно-функциональная организация G-белков. 9
Классификация по чувствительности к токеинам… 10
Сопряжение с эффекторными системами. 10
Регуляция активности G-белков. 11
Аденилатциклаза. 12
Фосфолипазы… 13
Протеинкиназы… 14
Фосфодиэстеразы… 16
Аденилатциклазная система. 17
Влияние бактериальных токсинов на активностьаденилатциклазы (АДФ-рибозилирование G-белков) 20
Инозитолфосфатная система. 21
Участие белка кальмодулина в инозитолфосфатной передачесигнала. 22
Саморегуляция системы… 23
α-субъединица: общие свойства. 23
β и γ субъединицы: общая характеристика. 24
G-белки: βγ-субъединицы… 25
ГТФ-связывающие белки образуют два основных семейства G-белков и низкомолекулярных ГТФ-связывающих белков. 28
Литература. 30
Введение
СигнальныеG-белки являются универсальными посредниками припередаче гормональных сигналов от рецепторов клеточной мембраны к эффекторнымбелкам, вызывающим конечный клеточный ответ. Когда семидоменная рецепторнаямолекула, локализованная в мембране сенсорной клетки, активируется какими-тоизменениями во внешней среде, она претерпевает конформационные изменения. Последниедетектируются
G-белкамисвязанными с мембраной, которые, в свою очередь, активируют эффекторныемолекулы в мембране. Часто это приводит к выделению вторичных мессенджеров вцитозоль.
Ониявляются объектом интенсивного изучения в связи с их участием во многих важныхфизиологических процессах. G-белки, участвующие в передаче сигнала, являютсячленами большого надсемейства гуанин-связывающих белков. G–белки- это прецизионные регуляторы, включающие или выключающие активность другихмолекул.
Примерно80% первичных мессенджеров (гормоны, нейротрансмиттеры, нейромодуляторы) взаимодействуютсо специфическими рецепторами, которые связаны с эффекторами через G-белки.
G-белки — белки,связывающие гуанозиновые нуклеотиды. G-белки, ассоциированные срецепторами, связаны с мембраной. В неактивном состоянии они связаны с GDР. Присвязывании рецептора с лигандом ГДФ замещается на ГТФ, в результате чегопроисходит активация. Процесс этот сравнительно медленный, протекающий втечение секунд — десятков секунд.
G-белкибиологических мембран имеют гетеротримерную структуру. Они состоят из большойα-субъединиц (около 45 килодальтон — кДа), а также меньших β иγ-субъединиц, α-субъединица обладает ГТФ-азной активностью, внеактивной (выключенной) форме она связывает молекулу ГДФ на активном сайте. Субъединицыβ и γ связаны между собой, и в физиологических условиях не могут бытьдиссоциированы. В неактивном состоянии βγ-комплекс непрочно связан сα-субъединицей. γ-субъединица связана с цитоплазматическим листкомбиологической мембраны геранил-гераниловой цепью (20 атомов углерода в цепи),близкой по структуре к холестерину. α-субъединица также связана смембраной жирной кислотой с длиной цепи в 14 атомов углерода (миристоеваякислота). Такие связи обеспечивают то, что комплекс G-белкаудерживается в плоскости мембраны, но в то же время способен легко двигаться вэтой плоскости. Легко себе представить, как весь комплекс G-белкас присоединенным ГДФ перемещается в плоскости мембраны под действием тепловыхсил, два семейства белков — гетеротримерные гуанозиннуклеотид связывающие белки(G-белки) и отдаленно родственные имгуанозинтрифосфатазы (ГТФ-азы) при связывании ГТФ могут включаться и активироватьпоследующие компоненты передачи сигнала от поверхности клетки. Малые ГТФ-азыучаствуют в контроле фундаментальных свойств клетки — полярности формы ипроцессов деления и дифференцировки. G-белки обычно регулируют болееспециализированные сигналы — продукцию вторичных мессенджеров. И те и другиеспособны гидролизовать GTР и таким образом выключать сигнал.
Посколькуβ — и γ-субъединицы G-белков чрезвычайно консервативны, G-белкипринято различать по их α-субъединицам. Кроме ГТФ-связывающего мотива,каждая последовательность Gальфа содержит как минимум один центр связываниядивалентных катионов, а также сайты ковалентной модификации бактериальнымитоксинами, катализирующими NAD-зависимые АДФ-рибозилтрансферазные реакции. G-белки,стимулирующие аденилатциклазу (Gs) или участвующие в фототрансдукции (Gt,трансдуцин) служат субстратами для АДФ-рибозилирования, катализируемогохолерным токсином по одному из остатков аргинина, что приводит к блокированию деактивацииэтих белков. Gs, G-белок, ингибирующий аденилатциклазу, (Gi) иG-белок с пока еще неизвестной функцией (Go) АДФ-рибозилируютсякоклюшным токсином по остатку цистеина, расположенному у С-конца. Эта модификацияпрепятствует взаимодействию между G-белком и рецепторами. Определенапоследовательность G-белка крысы (Gx), которыйоказался нечувствительным к коклюшному токсину.
G-белки — эторегуляторные белки, связывающие при активации ГТФ. Лучше всего изучены G-белки,стимулирующие и ингибирующие аденилатциклазу (Gs — белки и Gi-белкисоответственно). βı — адренорецепторы, β2 — адренорецепторы и D1рецепторы сопряжены с белком Gs, и поэтому стимуляция этих рецепторов сопровождаетсяактивацией аденилатциклазы и повышением внутриклеточной концентрации цАМФ — классическоговторого (внутриклеточного) посредника. Конечный ответ в разных клетках различени зависит от того, что представляет собой эффекторные фрагменты (фермент,ионный канал и пр) α2– адренорецепторы, М2-холинорецепторы и D2-рецепторысопряжены с белком Gi, и стимуляция этих рецепторов приводит к снижениюактивности аденилатциклазы и внутриклеточной концентрации цАМФ. Измененияактивности ферментов и других внутриклеточных белков и, соответственно,клеточных функций при этом противоположны тем, что наблюдаются при активациибелка Gs. α1-адренорецепторы (как и М1-холинорецепторы),видимо, сопряжены с другим, пока еще мало изученным типом G-белка.Этот белок иногда обозначают Gq. Он активирует фосфолипазу С, катализирующую распадмембранных фосфолипидов, в частности — фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата до ИЗФи ДГА. Оба эти вещества являются вторичными посредниками.
Связываниеагониста (гормона, нейромедиатора и др.) с соответствующим рецептором приводитк белок-белковому взаимодействию между рецептором и G-белком иускоряет диссоциацию ГДФ. В результате образуется короткоживущий комплексагонист — рецептор — G-белок, не связанный ни с каким нуклеотидом. Связываниес этим комплексом молекулы ГТФ снижает сродство рецептора к G-белку,что приводит к диссоциации комплекса и высвобождению рецептора. Потенциальнорецептор может активировать большое количество молекул G-белка,обеспечивая, таким образом, высокий коэффициент усиления внеклеточного сигналана данном этапе. Активированная α-субъединица G-белкадиссоциирует от βγ-субъединиц и вступает во взаимодействие ссоответствующим эффектором, оказывая на него активирующее или ингибирующеевоздействие.
α-субъeдиницас присоединенным с ней ГТФ способна взаимодействовать с эффектором в мембране — ферментами, такими, как аденилатциклаза, или, возможно, ионными каналами. Ферментможет активироваться или ингибироваться, а ионный канал — открываться илизакрываться. Конкретные примеры будут рассмотрены в последующих разделах. Взаимодействиес эффектором, однако, длится до тех пор, пока α — субъединица, являющаясяГТФазой, удерживает ГТФ. Так что, очень вскоре присоединенный ГТФ гидролизуетсядо ГДФ. Когда это происходит, α — субъединица снова меняет свою конформациюи теряет способность активировать эффектор. После этого α-ГДФвзаимодействует с βγ-комплексом и снова образует тримерный комплекс,завершая, таким образом, цикл. Предполагают также, что комплекс изβγ-субъединиц тоже может (прямо или опосредованно) влиять наэффекторные ферменты.
Такимиферментами являются аденилатциклаза, фосфолипаза С. G-белки такжерегулируют работу К и Са²+-ионных каналов, К G-белкам относятсяполипептид Gs, стимулирующий аденилатциклазу и регулирующийСа²+-ионные каналы, полипептид Gi, ингибирующий аденилатциклазу, ирегулирующий К+-каналы в клетках тканей мозга, Gt, трансдуцин,участвующий в передаче светового сигнала, Golf специфичныйбелок обонятельных ресничек и др. Все G-белки являются гетеротримерами,состоящими из субъединиц α, β‚ и γ в порядке уменьшениямолекулярной массы.
ВпоследствииГТФ, связанный с α-субъединицей G-белка, подвергается гидролизу,причем ферментом, катализирующим этот процесс, является сама α-субъединиц.Это приводит к диссоциации α-субъединицы от эффектора и реассоциациикомплекса α-ГДФ с βγ — субъединицами. Спонтанная активация G-белка,связанного с ГДФ — весьма маловероятный процесс.
Этотже механизм лежит в основе гормональной регуляции фосфоинозитидспецифичнойфосфолипазы С и фосфолипаза А2. Кроме того, было показано, что G-белкимогут непосредственно активировать ионные каналы.
Лимитирующейстадией процесса восстановления исходного состояния G-белка являетсяскорость диссоциации ГДФ от α-субъединицы G-белка. Скоростьдиссоциации увеличивается при взаимодействии G-белок-ГДФ сагонистсвязанным рецептором. Связывание ГТФ G-белкомприводит, очевидно, к образованию комплекса агонист-рецептор-G-белок.Аналог GТР-СТР-γ-S и Мg2+усиливает диссоциацию α-субъединицы из тримера G-белка. Однакоследует заметить, что каталитическая субъединица аденилатциклазы из мембранмозга быка хроматографически соочищается с α — и β-субъединицами Gs-белкаи вопрос диссоциации α-субъединиц из тримера G-белка дляактивации эффектора требует уточнения.
G-белкипроявляют значительный полиморфизм. Каждая из форм субъединиц G-белкавысокогомологична по структуре, близка по функциям, но отличается молекулярноймассой и электрофоретической подвижностью. Особенно широк полиморфизм инаиболее изучен для αs и αi G-белков.Так из мозга человека выделено 11 форм ДНК, ответственных за синтез αs-субъединиц,четыре вида которых клонированы и, предполагается, что они определяют синтезчетырех изоформ αs, в мозге человека. Для αi найдены, восновном, три изоформы αi1, αi2, αi3. Молекулярныемассы изоформы αs находятся в пределах 42-55 кДа, а αi 39-41 кДа. Распределениемолекулярных вариантов αi носит тканеспецифический характер: αi1представлена, в основном, в мозге, αi2 обнаружена внервной ткани и в клетках крови, αi3 представленав периферических тканях и отсутствует в мозге. Распределение генов, кодирующихсинтез трех изоформ αi по тканям примерно совпадает в ряду: человека, бык,крыса, мышь. Определение аминокислотной последовательности αi иαs показало, что изоформы αs или αiразличаются в области С — и N — концевой последовательности, связывающихся срецептором или эффектором. Предполагается, что полиморфизм α-субьединицопределяется многообразием рецепторов и их подтипов и разнообразием эффекторныхсистем.
αi-субъединицыGi кодируютсятремя различными структурными генами. Что касается изоформ α-субъединиц Gs-белков, то пока неясно, кодируютсяли изоформы разными структурными генами или это продукт одного гена споследующим внутренним альтернативным сплайсингом исходного РНК-транскрипта,или множественность их результат посттрансляционной модификации. В настоящеевремя известно 9 структурных генов, кодирующих G-белки и 12продуктов этих генов.
Из истории открытия С-белков
1.1971г. — впервые показана необходимость ГТФ для стимуляции аденилатциклазыглюкагоном.
2.1981г. — выделен белок Gt-трансдуцин, связывающий родопсин с фосфодиэстеразой сГТФ фоторецепторов.
З.1983г — выделен ГТФ-связываюший белок Gs, сопрягающий стимулирующие рецепторы саденилатциклазой.
4.1985-1988гт — показано, что фосфолипаза С и фосфолипаза А2 регулируютсягормонами и нейротрансмиттерами через Gp-белки.
5.В настоящее время G-белки разделены на несколько типов: четыре Gs, три Gi, Go, Gz/x (центральная нервная система и селезенка), Gt (трансдуцин), Golf (обонятельные нейроэпителиальные клетки). Структура и свойства
1.G-белки — гетеротримеры, в которых α-субъединицанепрочно связана с димером β-γ.
2.Все известные α-субъединицы (мол. масса – 50кДа) гомологичны, и убольшинства из них одинаковые (или очень сходные) b-субъединицы(мол. масса З5кДа) и γ-субъединицы (мол. масса 8кДа).
З.α-субъединица определяет специфичность связывания G-белка с рецептороми эффектором, уникальна для каждого G-белка.
4.α-субъединица связывает и гидролизует ГТФ (ГТФ-аза).
5.α-субъединица содержит высоко консервативный домен связывания и гидролизаГТФ (18 аминокислот из 350-395).
6.Выявлены участки связывания гуаниновых нуклеотидов и участки взаимодействия срецепторами (С-конец) и βγ-димерами (N-конец).
7.Выявлены участки АDР-рибозилирования (аргинин-202) при действии холерноготоксина и коклюшного токсина. Связь с мембраной
G-белкилокализованы на внутренней поверхности плазматической мембраны. Первичнаяструктура всех субъединиц G-белков не содержит гидрофобных, пронизывающихмембрану доменов.
1.Ассоциации G-белков с мембраной содействует ацилирование жирнокислотнымирадикалами. Выявлено два типа липидных модификаций субъединиц G-белков:миристоилирование и изопренилирование белковой цепи.
2.Показано для α-субъединиц Go — иGi-белковпосттрансляционное миристоилирование со стороны N-конца.
З.Для βγ-субъединиц также показаны посттрансляционные модификации(ацилирование).
4.Выявлены три последовательные посттрансляционные модификации, ответственные засвязывание ras-белков с мембраной.
5.Очищенные α-субъединицы проявляют гидрофильные свойства (без βγ- комплекса не могут связываться с искусственными фосфолипидными пузырьками). Стуктурно-функциональная организация G-белков
G-белки(ГТФ-связывающие белки) — универсальные посредники при передаче сигналов отрецепторов к ферментам клеточной мембраны, катализирующим образование вторичныхпосредников гормонального сигнала. G-белки — олигомеры, состоящие изα, β и γ-субъединиц. Состав димеров βγ незначительно различаютсяв разных тканях, но в пределах одной клетки все G-белки, какправило, имеют одинаковый комплект βγ-субъединиц. Поэтому G-белкипринято различать по их α-субъединицам. Выявлено 16 генов, кодирующихразличные α-субъединицы G-белков. Некоторые из генов имеют более одного белка,вследствие альтернативного сплайсинга РНК.
Каждаяа-субъединица в составе G-белка имеет специфические центры:
связыванияГТФ или ГДФ;
взаимодействияс рецептором;
связыванияс βγ-субъединицами;
фосфорилированияпод действием протеинкиназы С;
взаимодействияс ферментом аденилатциклазой или фосфолипазой С.
Вструктуре G-белков отсутствуют α-спиральные, пронизывающиемембрану домены. G-белки относят к группе «заякоренных» белков.Классификация по чувствительности к токеинам
1.ХТ (холерный токсин) приводит к постоянной активации аденилатциклазы (подавляяГТФ-азную активность Аs-субъединицы)
2.КТ (коклюшный токсин) тоже вызывает АDР-рибозилированиеα-субъединицы. Однако в этом случае модификация G-белкапрепятствует его взаимодействию с рецепторами, поэтому при активации рецептораА не ингибируется.
Почувствительности к холерному и коклюшному токсинам G-белки можноразбить на четыре группы: чувствительные только к холерному токсину (Gs), только к коклюшному (Gi и Go), субстраты обеих токсинов (Gt) и G-белки, α-субъединицы которых не чувствительны ник одному из токсинов. Сопряжение с эффекторными системами
ГТФ-связываюшиебелки управляют несколькими мембранными ферментами и рядом ионных каналов.
Вероятнос G-белками взаимодействует цитоскелет, благодаря чемугормоны регулируют секрецию и эндоцитоз. Из мембранных и внутриклеточныхмишеней G-белков лучше всего изучены аденилатциклаза и фосфодиэстеразаГМФ сетчатки глаза, активируемые, соответственно, Gzx и трансдуцином. Эти два фермента принципиальноотличаются друг от друга по структуре и механизму их регуляции G-белками.
Вотношении активации других G-белок зависимых систем ясности нет. G — белкиопосредуют не только активирующее, но и ингибирующее действие агонистов на внутриклеточныеэффекторные системы. G-белок зависимое ингибирование показано дляаденилатциклазы, потенциалправляемых кальциевых каналов, фосфолипазы С, Nа/К-АТФазы.
Исходяиз данных, можно предположить, что существует два механизма G-белокзависимого ингибирования аденилатциклазы. Один из них обусловлен действием βγ-субъединици, видимо, одинаков для всех G-белков, т.к βγ-субъединицы у них сходные. Второймеханизм заключается в специфическом ингибировании аденилатциклазыα-субъединицей белка Gi. Регуляция активности G-белков
Различаютнеактивную форму G-белка — комплекс αβγ-ГДФ и активированнуюформу αβγ-ГТФ. Активация G-белкапроисходит при взаимодействии с комплексом активатор-рецептор, изменениеконформации G-белка снижает сродство α-субъединицы к молекулеГДФ и увеличивает к ГТФ.
ЗаменаГДФ на ГТФ в активном центре G-белка нарушает комплементарность между α-ГТФ и βγ-субъединицами.Рецептор, связанный с сигнальной молекулой, может активировать большоеколичество молекул G-белка, таким образом обеспечивая усилениевнеклеточного сигнала на этом этапе.
Активированнаяα-субъединица G-белка (α-ГТФ) взаимодействует со специфическимбелком клеточной мембраны и изменяет его активность. Такими белками могут бытьферменты аденилатциклаза, фосфолипаза С, фосфодиэстераза цГМФ, Nа+-каналы,K+-каналы.
Следующийэтап цикла функционирования G-белка — дефосфорилирование ГТФ, связанного с α-субъединицей,причём фермент, катализирующий эту реакцию, — сама α-субъединица.
Дефосфорилированиеприводит к образованию комплекса α-ГДФ, который не комплиментаренспецифическому белку мембраны (например аденилатциклазе), но имеет высокое сродствок βγ-протомерам. G-белок возвращается к неактивной форме — αβγ-ГДФ.При последующей активации рецептора и замене молекулы ГДФ на ГТФ цикл повторяетсяснова. Таким образом, αβγ-субъединицы G-белковсовершают челночное движение, перенося стимулирующий или ингибирующий сигнал отрецептора, который активирован первичным посредником (например, гормоном), нафермент, катализирующий образование вторичного посредника.
Некоторыеформы протеинкиназ могут фосфорилировать α-субъединицы G — белков.Фосфорилированная α-субъединица не комплиментарна специфическому белку мембраны,например аденилатциклазе или фосфолипазе С, поэтому не может участвовать впередаче сигнала. Аденилатциклаза
Ферментаденилатциклаза, катализирующий превращение АТФ в цАМФ — ключевой фермент аденилатциклазнойсистемы передачи сигнала. Аденилатциклаза обнаружена во всех типах клеток.
Ферментотносят к группе интегральных белков клеточной мембраны, он имеет 12 трансмембранныхдоменов. Внеклеточные фрагменты аденилатциклазы гликозилированы. Цитоплазматическиедомены аденилатциклазы имеют два каталитических центра, ответственных заобразование цАМФ — вторичного посредника, участвующего в регуляции активностифермента протеинкиназы А.
Наактивность аденилатциклазы оказывают влияние как внеклеточные, так ивнутриклеточные регуляторы. Внеклеточные регуляторы (гормоны, эйкозаноиды,биогенные амины) осуществляют регуляцию через специфические рецепторы, которыес помощью α-субъединиц G-белков передают сигналы на аденилатциклазу. αs-субъединица(стимулирующая) при взаимодействии с аденилатциклазой активирует фермент,αi-субъединица (ингибирующая) ингибирует фермент. В своюочередь, аденилатциклаза стимулирует проявление ГТФ-фосфатазной активности α-субъединиц.В результате дефосфорилирования ГТФ образуются субъединицы αs-ГДФи αi-ГДФ, некомплементарные аденилатциклазе.
Из8 изученных изоформ аденилатциклазы 4 — Са2+-зависимые (активируются Са2+). Регуляцияаденилатциклазы внутриклеточным кальцием позволяет клетке интегрироватьактивность двух основных вторичных посредников цАМФ и Са2+. Фосфолипазы
Фосфолипазы- ферменты класса гидролаз, катализирующие катаболизм глицерофосфолипидов. Различаютфосфолипазы секреторные, входящие в состав панкреатического сока, и клеточныефосфолипазы. Клеточные фосфолипазы А1, А2, D, С различаются по специфичности к отщепляемой группе.Все фосфолипазы — кальций зависимые ферменты.
ФосфолипазаС — фермент, гидролизующий фосфоэфирную связь в глицерофосфолипидах. В клеткахчеловека идентифицировано 10 изоформ фосфолилазы С, различающихся помолекулярной массе, локализации, способу регуляции, субстратной специфичности. Вструктуре всех изоформ фосфолипазы С отсутствуют гидрофобные домены, которыемогли бы обеспечить их взаимодействие с мембраной. Однако некоторые формы фосфолипазыС связаны с мембраной с помощью гидрофобного «якоря» — ацильного остаткамиристиновой кислоты или за счёт взаимодействия с поверхностью бислоя. Каталитическаяактивность всех изоформ фосфолипазы С зависит от ионов кальция.
Большинствофосфолипаз С специфично в отношении фосфатидилинозитолов и практически негидролизует другие типы фосфолипидов. Активный фермент может гидролизовать до50% от общего количества фосфатидилинозитолов клеточной мембраны. При гидролизефосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (ФИФ2) образуются гидродугты диацилглицерол (ДАГ) и инозитол-1,4,5-трифосфат(ИФ3),служащие вторичными посредниками в трансмембранной передаче сигнала поинозитолфосфатному пути. Протеинкиназы
Всеполярные сигнальные молекулы, действующие на клетку-мишень через мембранные рецепторы,осуществляют свою биологическую функцию путём фосфорилирования специфическихбелков и ферментов, регулирующих метаболизм в клетке. Фосфорилирование изменяет(увеличивает или уменьшает) их активность. Катализируют фосфорилирование белков(протеинов) протеинкиназы по аминокислотным остаткам серина, треонина, тирозина.Протеинкиназы могут быть субъединицей мембранного рецептора, например тирозиноваяпротеинкиназа рецептора инсулина, активность которой регулируется гормоном. другаягруппа — протеинкиназы, регулируемые вторичными вестниками гормональногосигнала (цАМФ, цГМФ, Са, ДАГ), например протеинкиназа А, протеинкиназа С,протеинкиназа G, кальмодулинзависимые протеинкиназы и др.
1.Протеинкиназы А
ПротеинкиназыА (цАМФ-стимулируемые) участвуют в аденилатциклазной системе передачи сигнала. ПротеинкиназаА состоит из 4 субъединиц R2C2 — двухрегуляторных субъединиц (R2) и двухкаталитических (C2). Комплекс R2C2 не обладает ферментативной активностью.
КомплексR2C2 разнымиспособами прикрепляется к мембране. Некоторые формы протеинкиназы А «заякориваются»с помощью алифатического остатка миристиновой кислоты каталитических субъединиц.Во многих тканях протеинкиназа А связана с «заякоренным» белком АКАРs (отангл. сАМР — dependent protein kinase anchoring proteins). АКАРs имеет центр связывания длярегуляторных субъединиц протеинкиназы А. С помощью белка АКАРsпротеинкиназа А связывается с мембраной в области локализации ферментов,катализирующих образование цАМФ (аденилатциклаза) или его гидролиз(фосфодиэстераза), а также белков, в регуляции активности которых ферментпринимает участие, например потенциалзависимые Са2+-каналы.
Регуляторныесубъединицы протеинкиназы А имеют специфические центры для связывания цАМФ. ПрисоединениецАМФ к регуляторным субъединицам приводит к изменению конформации последних иснижению сродства каталитическим субъединицам С, происходит диссоциация посхеме:
цАМФ4 + R2C2 = цАМФ4R2 + С + С
СубъединицыС представляют собой активную форму протеинкиназы А, которая катализируетреакции фосфорилирования белков по серину и треонину. Каталитические субъединицыС у разных типов протеинкиназ А не идентичны, они различаются прежде всегоспецифичностью в отношении белков-субстратов.
2.Протеинкиназы С
ПротеинкиназыС участвуют в инозитолфосфатной системе передачи сигнала. Фермент состоит издвух функционально различных доменов — регуляторного и каталитическоо. Регуляторныйдомен содержит 2 структуры («цинковые пальцы»), образованныефрагментами пептидной цепи, богатыми цистеином, и содержащими два иона цинка.«Цинковые пальцы» участвуют в связывании: диацилглицерола. Другойфрагмент регуляторного домена имеет высокое сродство к Са2+. Повышениеконцентрации кальция в цитозоле увеличивает сродство протеинкиназы С кфосфатидилсерину мембраны. Транслокация протеинкиназы С к мембране позволяетферменту связаться с ДАГ, который ещё больше повышает сродство протеинкиназы Ск ионам кальция. Наиболее распространённые изоформы протеинкиназы Сактивируются Са2+, диацилглицеролом и фосфатидилсерином.
Каталитическийдомен имеет центр, связывающий АТФ и белок-субстрат. Активная форма ферментапротеинкиназы С фосфорилирует белки по остаткам серина и треонина. Снижениеконцентрации ионов кальция в клетке нарушает связь протеинкиназы С сфосфатидилсерином и диацилглицеролом, фермент переходит в неактивную форму иотделяется от мембраны.
3.Протеинкиназы G
Вотличие от протеинкиназы А, протеинкиназа G присутствуетне во всех тканях, её обнаруживают в лёгких, мозжечке, гладких мышцах и тромбоцитах.Изоформы протеинкиназы G могут быть связаны с мембраной или находиться вцитоплазме. Растворимая протеинкиназа G состоит из двух идентичныхсубъединиц, каждая из которых имеет два центра для связьвания цГМФ. ПрисоединениецГМФ к регуляторным центрам вызывает конформационные изменения субъединиц иповышает каталитическую активность фермента. Протеинкиназа G,подобно протеинкиназе А и С, специфична в отношении определенных белковых субстратов,которые она фосфорилирует по остаткам серина и треонина. Фосфодиэстеразы
Фосфодиэстеразы- ферменты, катализирующие превращение цАМФ или цГМФ в неактивные метаболитыАМФ или ГМФ. Фосфодиэстеразы, снижая концентрации вторичных посредников,разрывают цепь превращений, вызванных активатором рецептора.
Фосфодиэстеразыприсутствуют в клетках тканей в 2 формах: в форме растворимого белка имембранносвязанного. Формы фермента, связанные с мембраной, в разных тканяхсоставляют 5-40%. В одной и той же ткани могут присутствовать разные формыфосфодиэстеразы, различающиеся по сродству к субстратам, молекулярному весу,заряду, регуляторным свойствам и локализации в клетке.
Фосфодиэстеразыциклических нуклеотидов не обладают абсолютной специфичностью, поэтому, какправило, одна и та же форма фермента способна гидролизовагь как цАМФ, так ицГМф. Однако скорости гидролиза этих двух нуклеотидов под действием одной и тойже фосфодиэстеразы могут значительно различаться. Это зависит от того, какаяфосфодиэстераза присутствует в клетке — более специфичная в отношении цАМФ илиболее специфичная к цГМФ, от соотношения концентраций цАМФ и цГМФ в клетке и отдействия регуляторов фосфодиэстеразы.
Вбольшинстве тканей присутствует фосфодиэстераза — 1, более специфичная к цАМФ,активируемая Са2+, комплексом 4Са2+-кальмодулин и цГМФ. Аденилатциклазная система
Приучастии аденилатциклазной системы реализуются эффекты сотни
различныхпо своей природе сигнальных молекул гормонов, нейромедиаторов, эйкозаноидов.
Функционированиесистемы трансмембранной передачи сигналов обеспечивают белки: Rs-рецептор сигнальной молекулы,которая активирует аденилатциклазу, и Ri-рецептор сигнальной молекулы, которая ингибируетаденилатциклазу; Gs-стимулирующийи Gi-ингибирующийаденилатциклазу белки; ферменты аденилатциклаза (АЦ) и протеинкиназа А (ПКА).
Последовательностьсобытий, приводящих к активации аденилатциклазы:
связываниеактиватора аденилатциклазной системы, например гормона (Г) с рецептором Rs, приводит к изменению конформациирецептора и увеличению его сродства к Gs-белку. В результате образуется комплекс [Г] [R] [G-ГДФ];
присоединение[Г] [R] к G-ГДФ снижает сродство α-субъединицы Gs-белка к ГДФ и увеличиваетсродство к ГТФ. ГДФ замещается на ГТФ;
этовызывает диссоциацию комплекса. Отделившаяся субъединица α,связанная с молекулой ГТФ, обладает сродством к аденилатциклазе:
[Г][R] [G-ГТФ] = [Г] [R] + α-ГТФ +βγ
взаимодействиеα-субъединицы с аденилатциклазой приводит к изменению конформации ферментаи его активации, увеличивается скорость образования цАМФ из АТФ;
конформационныеизменения в комплексе [α-ГГФ] [АЦ] стимулируют повышение ГТФ-фосфатазнойактивности α-субъединицы. Протекает реакция дефосфорилирования ГТФ, и одиниз продуктов реакции — неорганический фосфат (Р) отделяется отα-субъединицы, а комплекс [α-ГДФ] сохраняется; скорость гидролизаопределяет проведения сигнала;
образованиев активном центре α-субъединицы молекулы ГДФ снижает его сродство к аденилатциклазе,но увеличивает сродство к βγ-субъединицам. Gs-белок возвращается к неактивной форме;
еслирецептор связан с активатором, например гормоном, цикл функционирования Gs-белка повторяется. Активацияпротеинкиназы А (ПКА)
молекулыцАМФ могут обратимо соединяться с регуляторными субъединицами ПКА
присоединениецАМФ к регуляторным субъединицам (R) вызывает диссоциацию комплекса С2R2 на комплексцАМФ4R2 и С + С
активнаяпротеинкиназа А фосфорилирует специфические белки по серину и треонину, врезультате изменяются конформация и активность фосфорилированных белков, чтоприводит к изменению скорости и направления регулируемых ими процессов в клетке.
концентрацияцАМФ в клетке может регулироваться, она зависит от соотношения активностей ферментоваденилатциклазы и фосфодиэстеразы.
Большуюроль в регуляции внутриклеточной сигнальной системы играет белок АКАРs.«Заякоренный» белок АКАРs участвует в сборке ферментныхкомплексов, включающих не только протеинкиназу А, но и фосфодиэстеразу ифосфопротеинфосфатазу.
Каскадныймеханизм усиления и подавления сигнала. Передача сигнала от мембранногорецептора через G-белок на фермент аденилатциклазу служит примеромкаскадной системы усиления этого сигнала. Одна молекула, активирующая рецептор,может «включать» несколько G-белков и затем каждый активируетнесколько молекул аденилатциклазы с образованием тысяч молекул цАМФ. На этомэтапе сигнал усиливается в 10²-10³ раз. Образующийся цАМФ «включают»другой фермент — протеинкиназу А, усиливая сигнал ещё в 1000 раз. Фосфорилированиеферментов протеинкиназой. А ещё больше усиливает сигнал, в результате суммарноеусиление равно 106-107 раз. Таким образом, по механизму каскадного усиленияодна молекула регулятора способна изменить активность миллионов других молекул.
Нодля любой из систем трансмембранной передачи сигнала клетка имеет другуюсистему, подавляющую этот сигнал. Каждый из этапов в ферментном каскаденаходится под контролем специальных подавляющих этот сигнал механизмов. Например,длительное действие гормона приводит к десенсибилизации мембранных рецепторов: онилибо инактивируются, либо вместе с гормоном погружаются в клетку посредствомэндоцитоза. В результате десенсибилизации рецепторов степень активацииаденилатциклазной системы снижается. Если в клетке длительное время повышенаконцентрация цАМФ (повышена активность протеинкиназы А), может происходитьфосфорилирование кальциевых каналов, что приводит к повышению концентрацииСа²+ в клетке. Калций активирует Са²+-зависимую фосфодиэстеразу,катализирующую превращение цАМФ в АМФ. В результате инактивации протеинкиназы А(R2С2) снижаетсяскорость фосфорилирования специфических ферментов. Завершает «выключение»системы фосфопротеинфосфатаза, дефосфорилирующая фосфопротеины. Влияние бактериальных токсинов на активностьаденилатциклазы (АДФ-рибозилирование G-белков)
Дляизучения функционирования G-белков аденилатциклазной системы были использованыэкзогенные бактериальные яды холерный и коклюшный токсины. Токсины вэкспериментальных условиях повышают активность аденилатциклазы практически вовсех клетках организма; так, холерный токсин может стимулировать секрециютиреоидных гормонов клетками щитовидной железы, стероидных гормонов клеткаминадпочечников, распад жиров в жировых клетках. Реакция разных клеток нахолерный токсин вызвана повышением уровня цАМФ в этих клетках.
Холерныйтоксин — олигомерный белок. Одна из субъединиц фермент АДФ-рибозилтрансфераза; проникаяв клетку, она катализирует присоединение АДФ-рибозы к αs-субъединице комплекса [αs — ГТФ] [АЦ] (этапактивации аденилатциклазы).
NAD+ + [αs, — ГТФ][АЦ] — [АДФ — рибозил — αs ГТФ] [АЦ] +никотинамид + Н+
АДФ-рибозилированиеингибирует проявление ГТФ-фосфатазной активности αs — субъединицы,не происходит дефосфорилированние ГТФ. Цикл функционирования G-белкаостанавливается на этапе активации фермента аденилатциклазы, отвечающего заобразование цАМФ из АТФ. Фермент аденилатциклаза сохраняет повышеннуюактивность в течение длительного времени.
Субъединицакоклюшного токсина, проникая в клетку, катализирует АДФ-рибозилирование αi-субъединицыактивированного Gi-белка(αi βγ-ГТФ).
NAD+ [αi βγ-ГТФ] — [АДФ-рибозил-αi βγ-ГТФ] + никотинамид +Н+
Модифицированнаяαi — субъединица сохраняет высокое сродство кβγ — субъединицам, те. Gi-белок теряет способностьдиссоциировать на αi — ГТФ и βγ-субъединицы. Таким образом,ингибирующий сигнал (αi-ГТФ) не достигает аденилатциклазы, значит в этомслучае возможна только её активация при связывании с αs-ГТФ.Действие коклюшного токсина на клетки тканей всегда приводит к повышению уровняцАМФ.
Симптомыхолеры и коклюша развиваются в результате действия токсинов, вырабатываемыхсоответствующими микроорганизмами. Инозитолфосфатная система
Функционированиеинозитолфосфатной системы трансмембранной передачи сигнала обеспечивают: R(рецептор), фосфолипаза С, Gрlс — белок, активирующий фосфолипазу С, белки иферменты мембран и цитозоля.
Последовательностьсобытий, приводящих к активации фосфолипазы С:
связываниесигнальной молекулы, например гормона с рецептором (R) вызывает изменениеконформации и увеличение сродства к Gplc-белку.
образованиекомплекса [Г] [R] [Gрlс ГДФ] приводит к снижению сродства α-протомера G рlсбелка к ГДФ и увеличению сродства к ГТФ. ГДФ заменяется на ГТФ.
этовызывает диссоциацию комплекса; отделившаяся α-субъединица, связанная смолекулой ГТФ, приобретает сродство к фосфолипазе С.
α-ГТФвзаимодействует с фосфолипазой С и активирует её. Под действием фосфолипазы Спроисходит гидролиз липида мембраны фосфатидилинозитол-4,5 — биофосфата (ФИФ2).
входе гидролиза образуется и выходит в цитозоль гидрофильное веществоинозитол-1,4,5-трифосфат (ИФ3). Другой продукт реакции диацилглицерол (ДАГ) остаётсяв мембране и участвует в активации фермента протеинкиназы С (ПКС).
инозитол-1,4,5-трифосфат(ИФ3)связывается специфическими центрами Са2 — канала мембраны ЭР, это приводит кизменению конформации белка и открытию канала — Са²+ поступает в цитозоль.В отсутствие в цитозоле ИФ3 канал закрыт.
Активацияпротеинкиназы С.
•Повышение концентрации Са²+ в цитозоле клетки увеличивает скорость
взаимодействияСа²+ с неактивным цитозольным ферментом протеинкиназой С(ПКС) и белкомкальмодулином, таким образом сигнал, принятый рецептором клетки, раздваивается.
•Связывание протеинкиназы С с ионами кальция позволяет ферменту вступать вкальций-опосредованное взаимодействие с молекулами «кислого»фосфолипида мембраны, фосфатидилсерина (ФС). Диацилглицерол, занимаяспецифические центры в протеинкиназе С, ещё более увеличивает её сродство кионам кальция.
•На внутренней стороне мембраны образуется ферментативный комплекс — [ПКС] [Са²+][ДАГ] [ФС] — активная протеинкиназа С, фосфорилирующая специфические ферментыпо серину и треонину. Участие белка кальмодулина в инозитолфосфатнойпередаче сигнала
Вклетках многих тканей присутствует белок кальмодулин, который функционирует каквнутриклеточный рецептор Са²+, он имеет 4 центра для связывания Са²+.Комплекс [кальмодулин] — [4Са²+] не обладает ферментативной активностью,но взаимодействие комплекса с различными белками и ферментами приводит к ихактивации.
Саморегуляция системы
Каки большинство систем трансмембранной передачи сигналов, инозитолфосфатнаясистема имеет не только механизм усиления, но и механизм подавления сигнала. Присутствующиев цитозоле инозитол-1,4,5-трифосфат ((ИФ3) и диацилглицерол (ДАГ) в мембране могут в результатесерии реакций опять превращаться в фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (ФИФ2). Ферменты,катализирующие восстановление фосфолипида, активируются фосфорилированиемпротеинкиназой С.
КонцентрацияСа²+ в клетке снижается до исходного уровня при действии Са²+-АТФ-азцитоплазматической мембраны и ЭР, а также Na+/Са²+-и Н+/Са²+-транслоказ(активный антипорт) клеточной и митохондриальной мембран.
Функционированиетранслоказ Са²+ и Са²+-АТФ-аз может активироваться:
комплексом[камьмодулин] [4 Са];
протеинкиназойА (фосфорилированием);
протеинкиназойС (фосфорилированием). Понижение концентрации Са2 в клетке и диацилглицерола вмембране приводит к изменению конформации протеинкиiiазы С, снижению еёсродства к фосфатидилсерину, фермеiтт диссоциирует в цитозоль (неактивная форма).
Фосфорилированныепротеинкиназой С ферменты и белки под действием фосфопротеинфосфатазы переходятв дефосфорилированную форму. α-субъединица: общие свойства
α-субъединицаиграет главную роль в функционировании G-белков. Онасвязывает ГТФ. Она обратимо взаимодействует с β и γ субъединицами, присоединяяськ ним, когда в центре находится ГДФ и диссоциируя, когда в центре ГТФ. Присвязывании ГТФ α субъединица активируется и приобретает способностьрегулировать эффекторные системы внутриклеточные. α субъединицы части G-белковмогут подвергаться химическим модификациям. Под воздействием холерного и коклюшноготоксинов происходит ФДФ-риболизирование белков по аргининовому и цистеиновомуостатку на С-конце, в результате чего нарушается нормальное функционирование G-белков.
Крометого, протеинкиназа С может фосфорилировать α-субъединицу очищенного G-белка,а in vivо белка Gz. По-видимому белки при этом инактивируются.
БольшинствоG-белков имеет α-субъединицы с молекулярным весомоколо 40 Кд. β и γ субъединицы: общая характеристика
Бетаи гамма субъединицы образуют комплекс друг с другом, распадающийся только вденатурирующих условиях. До конца их роль не ясна. В экспериментах странсдуцином, а затем с белком Giбыло показано, что субъединицы бета и гамма необходимы для взаимодействия G-белкас рецептором и замещения ГДФ на ГТФ.
Бета-гаммакомплекс прочно связан с мембраной и служит якорем для α-субъединицы. Приотделении α-субъединицы бета-гамма комплекс может переходить в цитоплазму.
Кромесвязывания и ингибирования активности α-субъединицы бета — гамма комплексв некоторых случаях оказывает прямое воздействие на эффекторные системы клетки.Он активирует фосфолипазу А2, взаимодействует с кальмодулином благодаря чемуингибирует активность аденилатциклазы мозга. G-бета-гаммакомплекс ингибирует стимуляцию
АС1 по средством Gs-альфа.
АС2 стимулируетсясвязыванием G-бета-гамма, но только в присутствии Gs — альфа.
АС3 такжестимулируется G-бета-гамма. Калиевые каналы сердца открываются присвязывании Gs-альфаи G-бета-гамма. Мембрана клеточная: стимуляция гидролизафосфолипидов. Мембрана клеточная: изменение содержания цАМФ. G-белки: βγ-субъединицы
Фосфорилированиерецепторов является одним из механизмов регуляции их активности. βγ-субъединицыG-белков могут осуществлять отрицательную обратнуюсвязь, активируя протеинкиназы, которые фосфорилируют рецепторы. Этипротеинкиназы называются GRК. К GRК протеинкиназам относятся родопсинкиназа и β-адренергическаякиназа. Фосфорилирование приводит к удалению рецептора киназа. Например, мускариновыеи адренорецепторы, фосфорилированные по серину и треонину на С-концевом домене,становятся мишенью для связывания арристина, что подготавливает их для удаленияэндоцитозом. Обычно на С-конце рецептора есть несколько участков для фосфорилированияразличными протеинкиназами. Известно, что слабый стимул (низкая концентрацияагониста) активирует протеинкиназу А, а сильный стимул активирует b-АRКпротеинкиназу, которая, фосфорилируя рецептор, прерывает передачу сигнала нааденилатциклазу и прекращает производство сАМР. Фосфорилирование,осуществляемое протеинкиназой А происходит тогда, когда занято 10% рецепторов. Приэтом фосфорилирование уже других, не занятых, рецепторов приводит косвобождению βγ-субъединиц и соответствующему фосфорилированию другойпротеинкиназой b-АRК.
βγ-субъединицьтобеспечивают локализацию, эффективное связывание и дезактивацию α-субъединиц,регулируют сродство рецепторов к их активирующим лигандам, понижают способностьGDР к диссоциации от субъединицы (стабилизацияинактивированного состояния), открывает мускариновый К+-канал в сердце,закрывают Са2+ — канал в пресинаптической мембране, активируют фосфолипазу РLА2 инекоторые изоформы фосфолипазы С, регулируют сродство рецептора к агонисту.
/>
/>
/>
/>
ГТФ(GТР) — связывающие белки.
Передачасигналов от рецепторов, на внутриклеточные эффекторные системы осуществляется спомощью ГТФ-связывающих белков. ГТФ-связывающие белки активируются \ дезактивируютсяс помощью специального механизма — ГТФ-фазного цикла. ГТФ-связывающие белки образуют два основныхсемейства G-белков и низкомолекулярных ГТФ-связывающихбелков
Всеэти белки сильно связывают ГТФ и превращают его в ГДФ, при этом происходит переходбелка из активированного в неактивное состояние. Свойства ГТФ-связывающихбелков. Основной структурной особенностью ГТФ-связывающих белков являетсяналичие домена связывания гуаниновых нуклеотидов. Наличие соответствующихконсенсусных аминокислотных последовательностей является однозначным указаниемна принадлежность белка к данному семейству.
/>
/>
Литература
1. Биохимия.3-е издание (исправленное). М; Издательскаягруппа ГЭОТАР-Медиа. 2006г.
2. Основы биохимии. А. Уайт, Ф Хендлер, Э. Смит, Р. Хилл,И. Леман.3 т. М; Мир1981 г.
3. Биохимия. Марри, Греннер. М; Высшая школа. 1993г.
4. Биохимия. Ленинджер, 1995г.
5. Биохимия. В.П. Комов., В.Н. Шведова. Дрофа; М: 2004г..
6. Общая биохимия. Учебное пособие по биохимии. Курслекций. М.Т. Генгин; 1997г.
7. Основы биохимии. Ю.Б. Филиппович. Издание второе,переработанное и дополненное. Высшая школа; М4, 1995г.