Методическиеуказания по лабораторной диагностике лептоспироза животных
1. Общиеположения
1.1. Лептоспирозпредставляет собой зооантропонозную природноочаговую инфекцию домашних,промысловых, многих видов диких животных и человека. Лептоспирозом болеюткрупный рогатый скот, свиньи, лошади, овцы, козы, олени, собаки, лисицы, песцыи животные других видов.
1.2.Возбудителем болезни являются лептоспиры. Они относятся к семейству спирохет (Spirochetaceae),роду лептоопир (Leptospira), виду патогенных лептоспир (interrogans). Последнийвключает 124 серологических варианта (серотипа – серовара). Серологическиеварианты по степени антигенного родства объединены в 18 серологических групп(приложение 1).
Возбудителемлептоспироза сельскохозяйственных животных на территории Советского Союзаявляются лептоспиры следующих серогрупп (см. табл.).Возбудители Свиньи Крупный рогатый скот Мелкий рогатый скот Основные Pomona Tarassovi Hebdomadis Pomona Grippotyphosa Tarassovi Grippotyphosa Pomona j Tarassovi Редко встречающиеся Hebdomadis Icterohaemorrhagiae Canicola Grippotyphosa Canicola Icterohaemorrhagiae Hebdomadis Icterohaemorrhagiae Canicola
Лептоспироз усельскохозяйственных животных других видов вызывают лептоспиры этих жесерогрупп.
Заражениекрупного и мелкого рогатого скота лептоспирами серогрупп Grippotyphosa иHebdomadis часто массовое, происходит преимущественно при выпасании натерритории природного очага от полевок и других видов мышевидных грызунов – основныххозяев лептоспир данных серогрупп. Заразившиеся сельскохозяйственные животныеявляются источником возбудителя инфекции.
Источником иосновными хозяевами лептоспир серогрупп Tarassovi и Pomona (серовариантыmanjakov и pomona) являются сельскохозяйственные животные и в первую очередьсвиньи и крупный рогатый скот. Природные очаги лептоспир Tarassovi натерритории Советского Союза не обнаружены. В природных очагах лептоспир Pomonaпаразитируют у полевых мышей лептоспиры сероварианта mozdok, который вызывает усельскохозяйственных животных только спорадические случаи инфекции.Лептоспирами Tarassovi и Pomona в большинстве случаев свиньи заражаются отсвиней, крупный рогатый скот от крупного рогатого скота. Может наблюдатьсямежвидовое заражение.
ЛептоспирамиIcterohaemorrhagiae и Canicola сельскохозяйственные животные инфицируются отосновных хозяев этих лептоспир: серых крыс и собак соответственно. Лептоспироз,вызванный этими возбудителями, протекает спорадически и не поражает большихгрупп животных.
1.3. Животные– лептоспироносители выделяют лептоспир во внешнюю среду с мочой и инфицируютводу, корма, пастбища, почву, подстилку и другие объекты внешней среды, через которыезаражаются здоровые животные.
Наиболееблагоприятная среда для сохранения лептоспир вне организма – вода открытыхводоемов: невысыхающие лужи, пруды, болота, медленно текущие речки, влажнаяпочва с реакцией, близкой к нейтральной.
Водный путьпередачи возбудителя инфекции основной.
Заражениевозможно при поедании трупов грызунов – лептоспироносителей или кормов,инфицированных мочой этих грызунов. Промысловые животные при клеточном ихсодержании заражаются в основном при поедании продуктов убоя больныхлептоспирозом животных.
Лептоспирыпроникают в организм животных и человека через поврежденные участки кожи(царапины, порезы, раны), слизистые оболочки ротовой полости, носа, глаз,половых путей.
1.4.Лептоспироз у сельскохозяйственных животных протекает остро, подостро,хронически и бессимптомно. Это наблюдается в любое время года, но у животных с пастбищнымсодержанием преимущественно в пастбищный период. Восприимчивы к лептоспирозуживотные всех возрастов. Болезнь характеризуется кратковременной лихорадкой,иногда желтушным окрашиванием и некрозами слизистых и отдельных участков кожи,нарушением функции желудочно-кишечного тракта.
У свиней иподсвинков, взрослого крупного рогатого скота, лошадей, овец и коз лептоспирозпротекает преимущественно бессимптомно. У не иммунных свиноматок и реже у коровлептоспироз сопровождается абортами в последний месяц беременности илирождением нежизнеспособного потомства. Аборты у свиноматок в ранееблагополучных хозяйствах могут быть массовыми.
При вспышкелептоспироза острое течение инфекции с характерными клиническими признакамиимеется у небольшого количества животных, а основная масса их переболеваетбессимптомно.
Независимо оттечения инфекции и вида животного на 5–7-й день после заражения в кровиживотного выявляются специфические антитела, а через 10–20 дней у ряда животныхразвивается лептоспироносительство, которое продолжается в течение несколькихмесяцев и до 1–2 лет.
Поголовьелептоспироносителей на неблагополучной по лептоспирозу ферме среди крупного имелкого рогатого скота составляет 1–5%, на отдельных фермах до 10–20%, средисвиней лептоспироносителями могут быть 30–80% животных и более.
Течениеболезни не зависит от серогрупповой принадлежности возбудителя. Однаколептоспироз у крупного рогатого скота, вызванный возбудителями группыHebdomadis, протекает чаще бессимптомно и только в отдельных случаях сопровождаетсялептоспироносительством.
1.5.Патологоанатомические изменения у павших от лептоспироза животныххарактеризуются геморрагическим диатезом и желтушным окрашиванием подкожнойклетчатки, увеличением в объеме печени, дряблой ее консистенцией, на разрезеглинистого цвета, увеличением лимфатических узлов, сочных на разрезе и скровоизлияниями. Мочевой пузырь переполнен мочой часто вишнево-красного цвета.Желтушное окрашивание тканей и кровавая моча не характерны для лептоспирозасвиней.
Прибессимптомном лептоспироносительстве видимые поражения локализуютсяпреимущественно в почках и проявляются изменениями, характерными для острогоили хронического паренхиматозного или интерстициального нефрита и дистрофии(мраморная окраска и изменение цвета поверхности, красные инфаркты, точечныесеро-белые некротические очажки, кровоизлияния, сглаженность границы междумозговым и корковым слоями).
2. Диагностикалептоспироза
2.1. Основаниемдля подозрения на неблагополучие хозяйства по лептоспирозу служат клиническиепризнаки, патологоанатомические изменения, обнаружение специфических антител вкрови отдельных животных и эпидемические показания (заболевание лептоспирозомлюдей).
2.2. В целяхсвоевременного выявления лептоспироза проводят исследование сыворотки кровиживотных по РМА или РА:
а) вплеменных хозяйствах (фермах) всех производителей и не менее 10% по РМА или 15%по РА коров, нетелей, свиноматок и кобыл один раз в год; мелкий рогатый скот иживотных других видов исследуют только при подозрении на заболеваниелептоспирозом;
б) наплемпредприятиях (станциях, пунктах) искусственного осеменения кровь всехпроизводителей два раза в год;
в) в группахсвиней, крупного и мелкого рогатого скота и лошадей – перед вводом (ввозом) ивыводом для племенных или пользовательных целей. При этом в группах до 25 головисследуют всех животных, в группах до 100 голов – не менее 25 животных, а вбольших группах – не менее 25% животных по РМА или 35% – по РА;
г) во всехслучаях при подозрении на лептоспироз.
2.3. Убольных, подозрительных по заболеванию и подозреваемых в заражении животныхкаждого скотного двора, свинарника, гурта, отары и т.д. исследуют кровь и мочу,а у павших–паренхиматозные органы. Кровь берут не менее чем от 50 животных.Повторное взятие крови производят через 7–10 дней у тех же животных.
Мочумикроскопируют непосредственно в хозяйстве не менее чем от 100 животных.Исследование прекращают после обнаружения лептоспир в одной из проб.
На фермах сменьшим поголовьем исследованию подвергают всех животных.
Взятиематериала для исследования и лабораторную диагностику лептоспироза проводят всоответствии с «Методическими указаниями по лабораторной диагностикелептоспироза животных», рекомендованными ГУВ МСХ СССР 15 октября 1975 г.
2.4. Порезультатам лабораторных исследований диагноз на лептоспироз считаютустановленным, а хозяйство (ферму, отделение, предприятие, станцию, пунктискусственного осеменения, свинарник, гурт и т.д.) неблагополучными полептоспирозу в любом из следующих случаев:
а) лептоспирыобнаружены при микроскопическом исследовании в крови или суспензии из органовживотных, абортированном плоде, моче «ли органах лабораторного животного,павшего после заражения исследуемым материалом;
б) культуралептоспир выделена из патологического материала или из органов лабораторногоживотного, зараженного исследуемым материалом;
в) лептоспирыобнаружены в гистологических срезах почек или печени, импрегнированных серебромпо Левадити;
г) установленонарастание титра антител в пять и более раз при повторном исследовании через 7–10дней сыворотки крови по РМА или при обнаружении антител у ранее нереагировавшихживотных;
д) специфическиеантитела обнаружены в сыворотке крови при однократном исследовании по РМА втитре 1: 100 и выше более чем у 25% обследованных животных или по РА (1–4креста) более чем у 20% животных, а для крупного рогатого скота, реагирующего слептоспирами группы Hebdomadis, и лошадей по РМА 1: 500 и выше или по РА на 3–4креста в том же проценте случаев.
2.5.Лептоспироз считают причиной гибели животных при наличии клинических признакови патологоанатомических изменений, характерных для лептоспироза, подтвержденныхобнаружением лептоспир в крови или паренхиматозных органах, или нарастаниемтитра антител не менее чем в пять раз.
Припостановке диагноза на лептоспироз необходимо проводить дифференциальнуюдиагностику и учитывать, что животные – лептоспироносители (особенно свиньи) и животные,имеющие в крови специфические антитела, могут погибать от различныхинфекционных и неинфекционных болезней.
2.6.Лептоспироз считают причиной абортов в следующих случаях:
а) приобнаружении лептоспир в органах (тканях) абортированного (мертворожденного)плода;
б) принарастании титра антител у абортировавшей матки не менее чем в пять раз;
в) привысоком титре антител (1:2500 и более) в группе абортировавших животных инизком титре (до 1: 500) или отрицательной реакции в группе здоровых животных.
3. Охранаблагополучных хозяйств от заноса лептоспироза
3.1. Благополучнымпо лептоспирозу считают хозяйство, отделение, ферму, где нет животных, больныхлептоспирозом, нет животных – лептоспироносителей и нет животных, в сывороткекрови которых обнаруживают по РМА или РА специфические антитела.
3.2. В целяхнедопущения заноса в благополучные хозяйства лептоспироза необходимо:
а)карантинировать в течение 30 дней всех поступающих в хозяйство животных;
б)комплектовать хозяйства (фермы) только клинически здоровыми животными, присерологическом исследовании сыворотки крови которых получены отрицательныерезультаты; для комплектования откормочных хозяйств (отделений, ферм)разрешается вводить клинически здоровых животных без исследования налептоспироз, но с обязательной вакцинацией их против лептоспироза в периодкарантинирования;
в) недопускать ввода (ввоза) в племенные хозяйства (отделения, фермы) животных илипродуктов убоя из неблагополучных хозяйств, независимо от результатовсерологического исследования;
г) исключитьконтакт животных хозяйства с животными, находящимися в личном пользовании,бродячими собаками и т.д.;
д) запретитьсовместный выпас и использование общего водопоя животных благополучных инеблагополучных групп;
е) использоватьдля поения животных воду артезианских скважин или водопроводной сети (качествоводы должно постоянно контролироваться);
ж) запретитьэксплуатацию производителей, сыворотка крови или сперма которых даетположительную РМА или РА;
з) устраиватьлетние лагеря на возвышенных сухих участках с хорошим стоком дождевых вод, бездоступа животных к воде открытых водоемов (пруд, озеро, река, ручей);
и) содержатьв надлежащем ветеринарно-санитарном состоянии пастбища, водопоя,животноводческие помещения, выгульные площадки, загоны и т.д., осушать сырые изаболоченные участки;
к)систематически уничтожать грызунов в животноводческих помещениях, на территориифермы, в местах складирования грубых кормов и т.д., а также исследоватьотловленных зверьков на лептоспироз;
л) вестистрогий учет случаев абортов, мертворождения, клинических признаков болезни ипадежа животных, направлять патологический материал для исследования влабораторию. Этот материал должен быть взят и исследован в течение 6 часов влетнее время и 10–12 часов в зимнее время или при условии хранения его вохлажденном состоянии;
м) недопускать участия в выставках собак, невакцинированных против лептоспироза;
н) нескармливать пушным зверям и собакам сырые продукты убоя больных лептоспирозомживотных и животных – лептоспироносителей;
о) выявлятьприродные очаги лептоспироза и не выпасать на их территории невакцинированныхживотных.
4. Специфическаяпрофилактика, лечение и дезинфекция при лептоспирозе
4.1. Дляспецифической профилактики лептоспироза применяют поливалентную феноловуювакцину, изготавливаемую в двух вариантах. Первый вариант вакцины включаетлептоспиры: Помона, Тарассови, Гриппотифоза, Иктерогеморрагия и Каникола;второй вариант – лептоспиры Помона, Тарассови, Гриппотифоза и Гебдомонадис.Применяют вакцину с учетом этиологической структуры лептоспироза.
4.2. Вакцинируютпротив лептоспироза всех восприимчивых животных в следующих случаях:
а) внеблагополучных по лептоспирозу хозяйствах;
б) воткормочных хозяйствах, где поголовье комплектуют без обследования «а лептоспироз;
в) вугрожаемых хозяйствах;
г) привыпасании животных в зоне природного очага лептоспироза;
д) привыявлении в хозяйстве животных, сыворотка крови которых реагирует налептоспироз по РМА или РА;
е) в районахс отгонным животноводством. Вакцинация профилактирует переболевание, аборты, исключаетперезаражение животных и формирование интенсивного очага лептоспироза.
4.3.Вакцинацию проводят в соответствии с Наставлением по применению поливалентной феноловойвакцины против лептоспироза сельскохозяйственных и промысловых животных,утвержденным ГУВ МСХ СССР 22 июля 1974 г. Вакцину вводят двукратно.
Продолжительностьиммунитета у поросят и ягнят, вакцинированных в месячном возрасте, не превышаеттрех месяцев, а у телят, вакцинированных в 14/2–2-месячном возрасте, 4–6-месячныхподсвинков, взрослых свиней и овец –• шести месяцев, у крупного рогатого скота,вакцинированного в возрасте от года и старше, – 12 месяцев. После истеченияуказанных сроков животных ревакцинируют.
Продолжительностьколострального иммунитета составляет у поросят и ягнят, полученных от матерей,вакцинированных за 35–75 дней до опороса (окота), – 1 –11/2 месяца, а утелят, полученных от коров, вакцинированных за 1!/2–6 месяцев до отела, – 14/2–2*/2месяца.
Телят,полученных от иммунных к лептоспирозу матерей, прививают в возрасте l’/г-2месяца, а ягнят и поросят– в возрасте 1 –1*/2 месяца.
Дляпрофилактики абортов лептоспирозной этиологии свиноматок необходимовакцинировать за 1–2 месяца
до покрытияили в первый месяц после покрытия, а крупный рогатый скот – в первые 1–3 месяцастельности.
При вспышкелептоспироза молодняк, полученный от невакцинированных или вакцинированных впоследний месяц беременности маток, обрабатывают в 1–3-дневном возрастегипврим1мунной сывороткой против лептоспироза в лечебной дозе и вакцинируют вмесячном возрасте.
4.4. Длялечения больных животных используют гипериммунную сыворотку и стрептомицин.
Сывороткасодержит специфические антитела к лептоспирам шести серогрупп: Помона,Тарассови, Гебдомонадис, Гриппотифоза, Иктерогеморрагия и Каникола.
Животные,подвергнутые лечению сывороткой при остром течении лептоспироза,выздоравливают, но остаются лептоспироносителями. Сыворотка не профилактируетаборты.
Сывороткаявляется хорошим дифференциально-диагностическим средством. Отсутствиелечебного эффекта после ее введения свидетельствует о нелептоспирознойэтиологии болезни.
Применяютсыворотку в дозах, указанных в Наставлении по ее применению или на этикеткефлакона с сывороткой.
Стрептомициниспользуют для лечения животных при клинически выраженном течении лептоспирозаи для лечения животных – лептоспироносителей. Его вводят через каждые 12 часовв течение 4–5 дней по 10–12 тысяч единиц на килограмм массы (веса) животного.
Стрептомицинотерапиюгрупп животных, в которых выявлены лептоспироносители, начинают через 7–10 днейпосле введения второй дозы вакцины.
4.5. Текущуюдезинфекцию проводят в неблагополучном по лептоспирозу хозяйстве после каждогослучая выделения больного животного и в последующем через каждые 10 дней до снятияограничений.
Перед снятиемограничений проводят механическую очистку и заключительную дезинфекцию.
При обработкестрептомицином групп животных, среди которых выявлены лептоспироносители,дезинфекцию проводят после второй инъекции антибиотика.
Обеззараживаниюподвергаются станки (стойла)’, выгульные площадки и другие места содержания животных,которые могли быть инфицированы мочой лептоспироносителей.
4.6.Лептоспиры быстро погибают при воздействии различных дезинфицирующих веществ.Для дезинфекции при лептоспирозе применяют осветленный раствор хлорной известис 2%-яым содержанием активного хлора, 2%-ный горячий раствор едкого натра, 3%-ныйгорячий раствор сернокарболовой смеси, 5%-ную эмульсию дезинфекционного(фенольного) креолина, 5%-ную эмульсию нафталина, 2%-ный раствор формальдегидаи другие вещества, используемые для дезинфекции животноводческих помещений иобъектов внешней среды, инфицированных патогенными неспоровыми микробами.
5. Мероприятияпо оздоровлению неблагополучных хозяйств
Общиемероприятия
5.1. Привыявлении в хозяйстве (на ферме, в отделении, стаде, свинарнике и т.д.) больныхлептоспирозом животных или животных – лептоспироносителей ветеринарныйспециалист, обслуживающий хозяйство, немедленно сообщает об этом руководителюхозяйства, главному ветеринарному врачу района и районнойсанитарно-эпидемиологической станции; одновременно выясняет источник заноса возбудителяинфекции в хозяйство и организует ‘мероприятия по ликвидации инфекции.
5.2. Хозяйство(ферма, отделение, гурт, индивидуальный двор и т.д.), в котором диагностированлептоспироз, в установленном порядке объявляют неблагополучным.
Главныйветеринарный врач района берет такие хозяйства на учет, разрабатывает совместнос их руководителями и специалистами план оздоровительных мероприятий иосуществляет контроль за их выполнением.
5.3. Планоздоровительных мероприятий по лептоспи-розу согласовывают с санитарно-эпидемиологическойстанцией, районной или областной ветеринарной лабораторией и вносят наутверждение в исполком районного (городского) Совета депутатов трудящихся. Вплане предусматривают необходимые диагностические исследования животных,соответствующие ветеринарно-санитарные и организационно-хозяйственныемероприятия, предусмотренные настоящей инструкцией, с указанием сроков ихпроведения и ответственных лиц.
5.4. Вхозяйстве, неблагополучном по лептоспирозу, вводят ограничения, на основаниикоторых запрещается:
а) выводить(вывозить) животных для племенных и пользовательных целей;
б) продаватьмолодняк рабочим и служащим в личное пользование;
в) вводить(ввозить) невакцинированных против лептоспироза животных;
г) перегруппировыватьживотных без ведома ветеринарного специалиста;
д) продавать продуктыубоя вынужденно убитых животных. Их используют согласно «Правилам ветеринарногоосмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясныхпродуктов»;
е)использовать воду открытых водоемов для поения животных;
ж) водитьздоровых животных в помещения, в которых ранее содержались больные животные, допроведения очистки, санитарного ремонта, дезинфекции и дератизации;
з) содержатьздоровых невакцинированных животных на пастбищных участках, на которыхвыпасались больные лептоспирозом животные (сухие участки пастбища в солнечную погодуразрешается использовать через 7 дней; на влажных и заболоченных участках,инфицированных лептоспирами, выпасают только вакцинированных животных);
и) допускатьна неблагополучную ферму восприимчивых к лептоспирозу животных других видов.
5.5. Животноводческиепомещения и территорию вокруг них содержат в надлежащем санитарном состоянии иулучшают условия содержания и ухода за животными; обезвреживание сточных вод,текущую и заключительную дезинфекцию помещений, загонов, выгульных площадок,оборудования, инвентаря и других объектов, а также дератизацию проводят всоответствии с «Инструкцией по проведению ветеринарной дезинфекции, дезинвазии,дезинсекции и дератизации».
5.6. Внеблагополучных по лептоспирозу хозяйствах животных осеменяют искусственноспермой от здоровых производителей.
5.7. Молоко,полученное от больных лептоспирозом животных, нагревают до кипения и используютв корм скоту. Молоко клинически здоровых коров (кобыл), сыворотка крови которыхдает положительную РМА или РА без нарастания титра, используют без ограничений.
5.8. Грубыекорма, в которых обнаружены зараженные лептоспирозом грызуны, скармливают тольковакцинированным против лептоспироза животным.
5.9.Животных, больных или подозрительных по заболеванию лептоспирозом, убивают насанитарной бойне, а при ее отсутствии – в убойном цехе мясокомбината в конце смены,после удаления продуктов убоя здоровых животных, с соблюдением мер личнойпрофилактики. Помещение и оборудование после убоя таких животных дезинфицируют.Продукты убоя используют в соответствии с «Правилами ветеринарного осмотраубойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов».
Специальныемероприятия
5.10. Внеблагополучном по лептоспирозу хозяйстве (ферме, отделении, стаде, свинарнике ит.д.) проводят клинический осмотр всех животных и измерение температуры уподозрительных по заболеванию животных.
Больных иподозрительных по заболеванию животных изолируют, уточняют диагноз и лечат(смотри пункт 4.4.), клинически здоровых. вакцинируют, как указано в пункте4.3.
5.11. Воткормочных комплексах и репродукторных хозяйствах, поголовье которых не имеетплеменной ценности, больных и подозрительных по заболеванию животных послелечения и выздоровления также вакцинируют и переводят в общее стадо. Всехживотных откармливают и сдают на убой. В ветеринарном свидетельстве указывают,что поголовье здорово, но вышло из неблагополучного по лептоспирозу хозяйства.
Ограниченияснимают после сдачи на убой всех животных неблагополучного хозяйства (фермы,отделения, свинарника, скотного двора и т.д.), проведения тщательной очистки,санитарного ремонта и заключительной дезинфекции.
5.12. Вплеменных и пользовательных хозяйствах больных и подозрительных по заболеваниюживотных изолируют, лечат и сдают на убой.
У остальныхживотных берут кровь для исследования по РМА или РА и, не ожидая результатовисследования, вакцинируют их, как указано в пункте 4.3.
а. Животных,сыворотка крови которых содержит специфические лептоспирозные антитела, кромегруппы Hebdomadis, изолируют откармливают и сдают на убой. Полученный от этих животныхмолодняк использовать на племенные цели запрещается.
б. Вхозяйствах (отделениях, фермах, гуртах), где сыворотка крови крупного рогатогоскота реагирует с лептоспирами только группы Hebdomadis, но нет клиническибольных лептоспирозом животных и не выявлены лептоспираноситеЛ’И, все поголовьепрививают против лептоспироза вакциной второго варианта.
Выводживотных из таких хозяйств для целей откорма не ограничивают.
Для племенныхи пользовательных целей выводят животных, сыворотка крови которых не имеетспецифических антител или всех клинически здоровых животных независимо отналичия антител после предварительной обработки стрептомицином, как указано впункте 4.4.
в. Молодняк,родившийся в хозяйстве до проведения противолептоспирозных мероприятий или в течениемесяца после их проведения, считают подозреваемым в заражении лептоспирозом.Его вакцинируют, как указано в пункте 4,3., и не используют для племенныхцелей.
Молодняк,родившийся в более поздние сроки от иммунных к лептоспирозу матерей,вакцинируют, содержат после отъема изолированно от других возрастных группживотных и после снятия ограничений реализуют для племенных целей.
г. Выводживотных для откорма разрешается в пределах данной области (края, республики)через месяц после последнего случая выздоровления больного животного ипроведения заключительных ветеринарно-санитарных мероприятий.
Выводживотных для племенных и пользовательных целей разрешается после снятияограничений.
д. Ограниченияснимают в племенных и пользовательных хозяйствах после установления ихблагополучия по лептоспирозу лабораторными методами исследования. Для этой целичерез два месяца после завершения противолептоспирозных мероприятий берут кровьу ремонтного молодняка, как указано в пункте 2.2.в., и исследуют по РМА или РА.У хряков, ремонтных и основных свиноматок и крупного рогатого скота различныхвозрастных групп, кроме того, берут по 100 проб мочи от каждой тысячи животных,но не менее чем от 100 животных на ферме.
Хозяйствосчитают благополучным при получении отрицательных результатов исследований увсех обследованных животных.
В случаевыявления животных – лептоспироносителей хозяйство (ферму, отделение, стадо,свинарник и т.д.) продолжают считать неблагополучным по лептоспирозу. Привыявлении положительных реакций только у отдельных животных проводятдополнительные исследования, как указано в пункте 2.3.
е. Повторныеисследования животных на лептоспироз в ранее неблагополучных племенныххозяйствах проводят через 6 месяцев после снятия ограничений, выполняют приэтом объем исследований, указанный в пункте 5.12.д.
5.13. Нанеблагополучных по лептоспирозу предприятиях (станциях, пунктах) искусственногоосеменения производителей, у которых при очередном плановом обследованиивыявлены специфические антитела, изолируют и прекращают получение от нихспермы. Малоценных производителей из числа положительно реагирующихвыбраковывают. Проводят 3-кратную микроскопию мочи всех производителей синтервалом в 1–2 дня и повторно исследуют кровь через 7–10 дней после первогоисследования.
а. Напредприятиях (станциях, пунктах), где все животные клинически здоровы, невыявлены лептоспироносители и не установлено ‘нарастание титра антител, всепоголовье вакцинируют, как указано в пункте 4.3. У производителей, не имеющихспецифических лептоспирозных антител, продолжают получение спермы. Всехпроизводителей обрабатывают стрептомицином, как указано в пункте 4.4., иконтролируют на лептоспироносительство путем 3-кратной микроскопии мочи. Приотрицательных результатах исследования предприятие продолжают считатьблагополучным по лептоспирозу.
6. Напредприятиях (станциях, пунктах), неблагополучных по лептоспирозу (смотри пункт2.4), прекращают получение спермы, уничтожают запасы (остатки) спермы,полученной от клинически больных производителей и лептоспироносителей. Больныхи подозрительных по заболеванию производителей (были или есть признаки болезни,лептоспиры в моче, положительная РМА или РА) изолируют. Клинически здоровыхживотных, у которых не выявлены специфические антитела, вакцинируют и обрабатываютстрептомицином в соответствии с пунктами 4.3 и 4.4. Через пять дней послеокончания обработки животных стрептомицином от них разрешается получать сперму.
Производителей,у которых установлено лептоспироносительство, и низкопродуктивных животных из числаположительно реагирующих по РМА или РА, выбраковывают.
Высокопродуктивныхпроизводителей, сыворотка которых реагирует положительно по РМА или РА,содержат изолированно в течение 3 месяцев. За этот срок у них после вакцинациии обработки стрептомицином исследуют через каждые 5–10 дней мочу путеммикроскопии на наличие лептоспир и, кроме того, через два месяца послеобработки мочу и сперму биопробой а взрослых кроликах. При отрицательныхрезультатах исследований от таких производителей разрешают получать сперму.
Предприятие(станцию, пункт) объявляют благополучным по лептоспирозу через 3 месяца послепоследнего случая выздоровления ‘больного животного или лептоспироносителя приполучении в последующие сроки отрицательных результатов исследования на лептоспирозу каждого производителя.
в. Повторноесерологическое исследование крови и микроскопию мочи всех производителей наранее неблагополучных по лептоспирозу предприятиях проводят через 3 месяца ипри получении отрицательных результатов – в сроки, указанные в пункте 2.2.6.
г. Напредприятиях (станциях, пунктах) искусственного осеменения, расположенных внеблагополучной или угрожаемой по лептоспирозу зоне, всех производителей вакцинируютпротив лептоспироза.
6. Порядокветеринарной обработки племенных и пользовательных животных, выводимых изхозяйств
6.1. Выводживотных (свиньи, крупный и мелкий рогатый скот, лошади), отобранных к продажеили переводу в другие хозяйства для племенных или пользовательских целей,разрешается только из благополучных по лептоспирозу хозяйств (ферм, отделений ит.д.).
6.2. Дляплеменных и пользовательных целей продают животных, сыворотка крови которых недает положительной реакции. Обследование животных проводят перед выводом путемоднократного исследования у них сыворотки крови по РМА или РА в ‘количестве,указанном в пункте 2.2.в.
6.3. Выводживотных разрешается без ограничений при отрицательных результатах исследованийпо всей группе.
При выявлениихотя бы одного животного, сыворотка крови которого положительно реагирует поРМА или РА, всю группу задерживают в карантине и решают вопрос о благополучиихозяйства по лептоспирозу, для чего проводят исследования, как указано в пункте2.3. Если хозяйство благополучно по лептоспирозу, то всю группу, в которойвыявлены положительно реагирующие животные, обрабатывают стрептомицином (пункт4.4). Животных, не имеющих специфических антител к лепто-спирам, выводят бездополнительных исследований, а положительно реагирующих оставляют в хозяйстведля дополнительных исследований или откорма с последующим убоем.
Крупныйрогатый скот, реагирующий с лептоспирами группы Hebdomadis, обрабатываютстрептомицином и выводят без ограничений. В случае признания хозяйстванеблагополучным по лептоспирозу руководствуются при выводе животных пунктами5.12.6., 5.12.в., 5.12.г.
7. Охраналюдей от заражения лептоспирозом
7.1.Руководители хозяйства обязаны:
а) обеспечитьвсех работников животноводства спецодеждой и спецобувью, включая резиновыесапоги, халаты, прорезиненный фартук, нарукавники, перчатки, косынку иличепчик;
б) обеспечитьинструктаж обслуживающего персонала о мерах личной гигиены и промсанитарии прилептоспирозе;
в) иметь вкаждом животноводческом помещении (скотном дворе, свинарнике, кошаре и т.д.)умывальник, мыло, полотенце, аптечку первой помощи, емкости с дезратвором(пункт 4.6), а также помещения, оборудованные для хранения спецодежды испецобуви;
г) иметь вхозяйстве санитарный журнал для записи указаний «предложений специалистовветеринарно-санитарного надзора и органов здравоохранения, обеспечитьвыполнение сделанных указаний и предложений;
д) припоявлении заболевания лептоспирозом среди животных немедленно принять меры попредупреждению заражения людей и оказанию помощи по выявлению источниковвозбудителя инфекции.
7.2. Лица,обслуживающие животных в неблагополучных по лептоспирозу хозяйствах, должнывыполнять правила личной профилактики и быть вакцинированными противлептоспироза.
Методическиеуказания по лабораторной диагностике лептоспироза
Диагноз налептоспироз устанавливают бактериологическим, серологическим и гистологическимметодами исследования с учетом эпизоотологических, клинических ипатологоанатомических данных и проведением дифференциальной диагностики.
1. Бактериологическаядиагностика лептоспироза
Бактериологическаядиагностика основана на обнаружении лептоспир в исследуемом материале путеммикроскопии или выделения культуры и складывается из следующих этапов:
– взятиепатологического материала;
– микроскопияв темном поле микроскопа;
– выделениекультур лептоспир посевом в специальные среды или биологической пробой налабораторных животных;
– идентификацияи дифференциация выделенных культур.
1.1. Порядоквзятия материала для лабораторного анализа
1.1.1.Материалом для прижизненной диагностики служат кровь и моча, для посмертной – трупымелких животных. От трупов ирупных животных берут сердце, кусочкипаренхиматозных органов, почку, транссудат из грудной и брюшной полостей, перикардиальнуюжидкость, мочевой пузырь с содержимым, спинномозговую жидкость.
Абортированныйплод доставляют в лабораторию целиком или берут желудок с содержимым ипаренхиматозные органы плода.
1.1.2. Мочусобирают при естественном мочеиспускании в чистые пробирки, закрепленные напроволоке, или в банки, чашки Петри, кружки и т.д. Легче всего брать пробы послеутреннего подъема животных, а у свиней в любое время дня после 1–2-часовоголежания. У коров и свиноматок мочу можно брать катетером.
1.1.3. Кровьв количестве 3–5 мл берут для бактериологического исследования в периодлихорадки на 1–7-й день болезни, для серологического исследования – 5–10 мл ине ранее чем через 5–7 дней после проявления клинических признаков болезни иличерез 60 дней после введения вакцины.
1.1.4. Почкуизвлекают в невскрытой капсуле. Сердце, мочевой пузырь и желудок плода берут ссодержимым, для чего накладывают лигатуры на соответствующие сосуды исфинктеры. Каждый орган или кусочек органа завертывают отдельно в пергамент.
1.1.5.Ликвор, транссудат, спинномозговую жидкость и другие жидкие субстраты насасываютстерильным шприцем или пипеткой в стерильные пробирки.
1.1.6. Водуиз водоисточника для обнаружения лептоспир берут в объеме 1,5–2 л встерильные колбы с ватно-марлевыми пробками.
1.1.7. Взятыйматериал помещают в ящик, опечатывают и направляют в лабораторию с нарочным.
1.1.8. Патологическийматериал должен быть взят и исследован в течение 6 часов в летнее время и 10–12часов – при условии хранения его в охлажденном состоянии.
1.1.9. Микроскопиямочи должна быть закончена при температуре 30–40 °С в течение 3 часов, 25–30 °С– 4– 5 часов, 20–25 °С – 6–8 часов, 16–20 °С – до 10–12 часов смомента взятия.
Вероятностьобнаружения лептоспир в исследуемом материале в более поздние сроки неисключена, но значительно снижается.
1.1.10. Ветеринарныйспециалист, направляя материал в лабораторию для исследования на лептоспироз,должен рассчитывать, чтобы взятие материала, доставка в лабораторию ипроведение исследования укладывались в сроки выживания лептоспир впатологическом материале, в противном случае ответ будет заведомоотрицательным.
Всопроводительной к патологическому материалу должно быть указано время гибелиживотного или время взятия пробы при жизни.
1.2.Микроскопическое исследование
1.2.1. Длямикроскопического исследования на лептоспироз необходимы:
– биологическиймикроскоп (МБИ-3, МБИ-1, МБИ-11 и др.);
– конденсортемного поля (ОИ-7, ОЙ-13 и др.);
– осветитель(ОИ-19, ОИ-21 и др.) с точечной лампой;
– предметныестекла толщиной не более 0,8–1,1 мм;
– покровныестекла стандартные.
Стекла,используемые для микроскопии, должны быть бесцветными, прозрачными, чистыми,без царапин и бликов.
1.2.2. Порядокмикроскопии в темном поле следующий. Осветитель соединяют с микроскопомсоединительной планкой. Передвигая лампочку осветителя, фокусируют свет нацентре плоского зеркала микроскопа. При этом четко должны быть видны завиткиспирали. Верхнюю линзу конденсора устанавливают на уровне предметного столика.Центрируют конденсор с помощью регулировочных винтов по оптической осимикроскопа. На верхней линзе конденсора при правильной установке виденравномерно освещенный круг.
Препарат длямикроскопических исследований готовят по принципу раздавленной капли. Небольшойобъем исследуемого материала наносят пипеткой или бактериологической петлей напредметное стекло и накрывают покровным стеклом, избегая образования пузырьковвоздуха. На одном предметном стекле готовят три раздавленные капли.
На верхнююлинзу конденсора наносят каплю дистиллированной воды и устанавливают препаратдля микроскопии. Пространство между линзой конденсора и предметным стекломдолжно быть заполнено тонким слоем воды, без пузырьков воздуха, что уменьшаетрассеивание световых лучей. Фокус конденсора должен находиться в плоскостипрепарата. Конденсор при этом обычно вплотную прилегает к стеклу. Иногда взависимости от толщины препарата его приходится опускать на 0,5–1 мм.
Микроскопируютисследуемый материал при увеличении 40X7–10 и 20X1,5X7, а для более детальногорассмотрения препарата–при увеличении 40ХЮ-15 или 40X1,5X10.
1.3.Характеристика лептоспир
1.3.1.Лептоспиры при рассмотрении в темном поле микроскопа представляют собой спиралеподобныетонкие серебристые нити, – концы которых, оба или один, загнуты и булавовидноутолщены. Встречаются и бескрючковые формы лептоспир. Лептоспиры подвижны. Вжидких средах обычными формами движения являются: вращательное, прямолинейноепоступательное с одновременным вращением вокруг собственной оси и круговые.Одна и та же особь может совершать и вращательные и поступательные движения.
1.3.2.Морфология и характер движения настолько типичны, что позволяют безошибочнораспознавать лептоспир в патологическом материале. Кроме того, лептоспиры примикроскопии в отличие от других микроорганизмов никогда не бывают блестящими.
1.3.3. Возможностьбезошибочной дифференциации лептоспир от микроорганизмов других видов поморфологическим признакам дает право при лептоспирозе устанавливать диагнозтолько на основании микроскопических исследований, без последующего выделениячистых культур и их идентификации.
1.4.Микроскопия мочи
1.4.1. Мочумикроскопируют в нативном виде или после центрифугирования. Прозрачную мочу, несодержащую кристаллов солей, хлопьев, спермиев и других посторонних частиц,центрифугируют при 10–15 тыс. об/мин в течение 30 минут, сливают надосадочнуюжидкость, осадок ресуспензируют в оставшейся капле мочи и микроскопируют.
Мочу,содержащую значительное количество посторонних частиц, очищаютцентрифугированием при 3 тыс. об/мин в течение 10 минут, затем сливаютнадосадочную жидкость и центрифугируют ее для осаждения лептоспир при 10–15тыс. об/мин в течение 30 минут.
При массовомисследовании животных в хозяйстве готовят по одной, а при наличии немногихживотных – не менее трех раздавленных капель из каждой пробы мочи.Просматривают 50 и более полей зрения в каждой капле.
1.4.2. Лептоспирс активной подвижностью обнаруживают примерно в 50% положительных проб, востальных случаях они неподвижны и довольно часто имеют измененную морфологию.Количество их также бывает различным. В моче примерно у 30% животных – лептоспироносителейсодержатся по 1–2, реже по 5–7 и очень редко по 10–15 лептоспир в каждом полезрения, в 30 – 35% ‘ случаев удается обнаружить 1–2 лептоспиры в 5–’10 полях. Востальных случаях выявляют 1–2 лептоспиры в 20–50 и более полях зрения.
В кислой мочес рН 5,0–6,0 лептоспиры быстро утрачивают подвижность и погибают. Некоторыемертвые клетки сохраняют форму, типичную для лептоспир, но у них по длине телабывает видна зернистость, довольно часто концевые крючки распрямлены.
1.5.Микроскопия крови
1.5.1. Кровь,взятую от больного или подозреваемого в заболевании животного, смешивают сдвойным количеством 1,5%-ного раствора лимоннокислого натрия, центрифугируютпри 2–3 тыс. об/мин в течение 5 минут или отстаивают в течение часа,микроскопируют прозрачный надосадочный слой жидкости. Целесообразно осаждениелептоспир из надосадочной жидкости проводить центрифугированием при 10–15 тыс.об/мин в течение 30 минут.
1.6.Микроскопия суспензии из ткани органов
1.6.1. Прибессимптомном течении лептоспироза суспензию готовят из кусочков коркового слояпочки, а при остром течении – из почки и печени. У абортированного плода микроскопируют’Суспензию из всех органов.
1.6.2. Кусочкиисследуемого органа весом 2–3 г. растирают в ступке с 5–7 мл питательной среды,физиологического раствора или стерильной воды до получения гомогенной взвеси.Суспензию отстаивают в холодильнике 1–2 часа или центрифугируют при 3 тыс.об/мин в течение 10 минут и микроскопируют надосадочную жидкость.
1.6.3.Транссудат из грудной и брюшной полостей, околосердечную жидкость, содержимоежелудка плода и другие жидкие субстраты микроскопируют по той же методике, чтои мочу.
1.6.4. Из пробкрови и суспензии каждого органа готовят не менее трех раздавленных капель ипросматривают в каждой из них не менее 50 полей зрения
1.7. Дифференциальнаядиагностика
1.7.1. Примикроскопической диагностике лептоспиры необходимо дифференцировать от нитейфибрина, обломков хвостовых частей спермиев, разрушенных эритроцитов, спиралло-и вибриоподобных микроорганизмов, интерспир у хряков и других микроорганизмов.
1.7.2. Спермиипостоянно содержатся в моче быков и хряков и часто в большом количестве.Обломки их хвостовых частей не имеют концевых крючков, неподвижны и вследствиепреломления света кажутся блестящими.
1.7.3. Нити фибринапостоянно обнаруживают в крови, транссудате и иногда в «моче. Они не преломляютсвет, но не имеют концевых крючков и не обладают подвижностью.
1.7.4.Содержимое эритроцитов может выдавливаться через поры мембраны в виде тонкихнитей. Такой эритроцит очень напоминает «паучок» из агглютинированныхлептоспир. Свободный конец каждой нити под действием тока жидкости непрерывно извиваетсяи колеблется. Часть нитей отрывается от эритроцитов и очень напоминает по формеи размерам лептоспир, но в отличие от последних они тоньше, не имеют крючков ине способны самостоятельно двигаться.
1.7.5. Спирилла-и вибриоподобные микроорганизмы обнаруживают в 10–15% случаев в моче свиней икрупного рогатого скота и постоянно – в крови, спинномозговой жидкости,суспензии из органов, а также в тканях и жидкостях абортированных плодов. Этимикроорганизмы отличаются от лептоспир змееподобным движением и отсутствиемконцевых крючков.
1.7.6.Интерспиры обитают в препуциальном мешке свиней. В моче, взятой приестественном мочеиспускании, их обнаруживают повсеместно в 50–80% случаев. Вмоче, взятой из мочевого пузыря, они не содержатся. Интерспиры подвижны. Обаили один конец микробной клетки перемещается судорожными, маятникообразными сширокой амплитудой движениями. После нескольких колебательных движений клетканекоторое время остается неподвижной, а затем снова можно наблюдать несколькоочередных движений. Подвижность сохраняется не более 1–2 часов с моментаполучения мочи. Неподвижная интерспира имеет, так же как и лептоспира, один илидва крючка и не преломляет свет, но в отличие от лептоспир у шее видныпервичные завитки и тело клетки запоминает нить, состоящую из бусинок. Концыкрючков заострены.
1.7.7. Другиемикроорганизмы дифференцируют от лептоспир по форме и характеру движения, и всеони, кроме того, преломляют свет и кажутся блестящими.
1.8.Выделение культур лептоспир
1.8.1. Выделениелептоспир из крови при жизни возможно в первые 5–7 дней болезни в периодлихорадки. Для этой цели кровь из яремной или ушной вены вносят черезстерильную иглу по 3–5 капель в 5–7 пробирок с питательной средой или высевают изпробы крови, присланной в лабораторию (приложения 2 и 3).
1.8.2. Оттрупа при диагностическом убое высевают пастеровской пипеткой кровь из сердца,ткани печени и почки, а от абортированного плода, кроме того, и из содержимогожелудка. При убое клинически здоровых животных высевы делают из почки имочевого пузыря. Из каждого органа засевают 3–5 пробирок с питательной средой.
1.8.3. Длявыделения культур из почки ее освобождают от капсулы, поверхность прижигают шпателемили горящим спиртовым тампоном, пипетку вводят параллельно поверхности вкорковый слой. Высев делают у крупного рогатого скота из 2–3 долей почки, усвиней– из нескольких участков почки.
1.8.4. Высевыиз других органов делают по общепринятой методике.
Мочу, ликвор,околосердечный, брюшной транссудат и другие жидкие биосубстраты засевают по 1–3капли в 3–5 пробирок с питательной средой.
1.8.5. Посевыкультивируют при температуре 28 – 30° в течение трех месяцев. Лептоспиры, размножаясьв питательной среде, не изменяют ее внешнего вида. Поэтому для выявления росталептоспир через 3, 5, 7, 10 и далее каждые 5 дней культивирования из всехпробирок микроскопируют капли, которые наносят на предметное стеклобактериологической петлей. Большинство культур вырастает через 7–20 дней.Иногда лептоспиры обнаруживают в среде на 3–5-й день, через 1–2 месяца и оченьредко через 2–3 месяца культивирования.
СодержимоеКаждой пробирки, в которой обнаружены лептоспиры, пересевают в 3–5 пробирок сосвежей питательной средой. Пробирки с обильным ростом посторонней микрофлорыуничтожают.
1.9. Порядоксохранения культур
1.9.1. Пересевыкультур лептоспир производят пастеровскими пипетками. В пробирку с 5–10 млпитательной среды вносят 0,5–1,0 мл культуры. Максимальное накопление лептоспирнаблюдается через 4–7 дней культивирования при температуре 28–30°.
1.9.2. Рост ичистоту культуры лептоспир в жидких питательных средах контролируютмикроскопически в темном поле микроскопа и макроскопически – просмотромпробирок с культурами в луче света от осветителя. При этом после встряхивания впитательной среде четко просматриваются муаровые волны, образуемые выросшейкультурой.
Культурулептоспир пересевают через каждые 10–15 дней не менее чем в 3–4 пробирки.
1.9.3. Штаммылептоопир, постоянно поддерживаемые б лаборатории, можно хранить в пробиркахпод вазелиновым маслом, в запаянных ампулах, в морозильной камере при –70–80 °Сили при температуре жидкого азота (–190 °С). Лептоспиры консервируют любымиз этих методов после выращивания в сывороточной среде до максимальногонакопления.
В пробирку накультуру наслаивают 1 – 1,5 мл стерильного вазелинового масла или культурурасфасовывают в стерильные 1–5 мл ампулы из нейтрального стекла и запаивают.
Хранятпробирки и ампулы в темном месте при комнатной температуре. В таких условияхлептоспиры можно хранить без пересевов в течение трех месяцев.
1.9.4. Дляхранения в замороженном состоянии культуры расфасовывают в ампулы, запаивают,охлаждают до 0–4 °С и помещают в сосуды Дьюара, заполненные азотом, илиморозильную камеру.
В жидкомазоте лептоспиры можно хранить без пересевов в течение года, при этом онизаметно не изменяют своих биологических свойств.
1.10. Очистказагрязненных культур лептоспир
1.10.1. Культурылептоспир, загрязненные микрофлорой, очищают биологическим методом, фильтрациейчерез бактерийные фильтры или пересевом на плотные питательные среды.
1.10.2. Дляочистки биологическим методом загрязненную культуру вводят внутрибрюшинноморским свинкам в дозе 1–2 мл, крольчонку – 1–2 мл, хомяку или мыши – 0,5 мл.Через 30–60 минут кровь из сердца зараженного животного высевают в пробирки спитательной средой.
1.10.3. Лептоспирыпроходят через асбестовые фильтровальные пластины марки СФ и свечи Шимберляна Л-5.Для очистки методом фильтрации загрязненную культуру фильтруют черезпростерилизованный фильтр. Фильтрат рассеивают в 5–10 пробирок с питательнойсредой. В высевах из фильтрата получают чистую культуру лептоспир.
1.11.Постановка биологической пробы
1.11.1. Восприимчивык лептоспирозу при экспериментальном заражении золотистые хомяки, крольчата,морские свинки, крапчатые суслики, щенки собак, котята, белые и серые мыши.
Дляповседневной практической работы используют золотистых хомяков 20–30-дневноговозраста и крольчат-сосунов в возрасте 10–20 дней.
Молодыесвинки (3–5-недельного возраста) весом 150–200 г. наиболее чувствительны кL. icterohaemorrhagiae, в меньшей степени – к L. pomona и мало чувствительны клептоспирам других серологических групп.
1.11.2.Лабораторных животных заражают для выделения культур лептоспир изпатологического материала и объектов внешней среды, очистки культур лептоспирот посторонней микрофлоры, определения вирулентности выделенных культур идифференциации от сапрофитов.
1.11.3. Длявыделения культур лептоспир животных заражают кровью, мочой, суспензией изпаренхиматозных органов животных (абортированного плода) или спермой.
Исследуемыйматериал вводят подкожно или внутрибрюшинно хомякам от 0,3–0,5 до 1 мл,крольчатам – 2–3 мл.
1.11.4. На каждуюпробу исследуемого материала необходимо брать по два зверька: одного из нихубивают на 4–5-й, другого, если он не погибает, на 14–16-й день послезаражения. Кровь зверька, убитого на 14–16-й день после заражения, исследуют пореакции микроагглютинации, начиная с разведения 1:10 с лептоспира-ми 13серологических групп. Положительная РМА свидетельствует о наличии лептоспйр висследуемом материале.
1.11.5. Высевыот убитых и павших зверьков делают из сердца, печени и почки в 2–3 пробирки изкаждого органа. Вторую почку, кусочки печени, транссудат из грудной и брюшнойполостей, околосердечную жидкость и содержимое мочевого пузыря микроскопируют.
1.11.6. Культурылептоспир чаще удается выделить из органов зверька в период проявления клиническихпризнаков болезни, проявляющихся отказом от корма, вялостью, дрожью,взъерошенностью шерсти, конъюнктивитом, желтушностью видимых слизистых оболочеки т.д.
1.11.7. Укрольчат и морских свинок проводят после заражения термометрию. У крольчатнормальной температурой считается 38,5–39,5 °С, у свинок – 38–39,5 °С.В период лихорадки кровь берут из уха или сердца шприцем для микроскопии ипосева.
1.11.8. Патогенностьи вирулентность выделенных культур лептоспир проверяют на золотистых хомякахили крольчатах. Патогенные лептоспиры способны размножаться в организмеживотного, вызывать клинические проявления болезни, характерныепатологоанатомические изменения и гибель животного. Лептоспиры-сапрофиты такимисвойствами не обладают. Заражение животных проводят внутрибрюшинно 5–7-дневнойкультурой, содержащей 70–100 лептоспир в поле зрения микроскопа. Культуры лептоспир,убивающие золотистых хомяков на 5–12-й день дозой менее 0,1 мл, считаютвысоковирулентными, 0,2–0,4 мл – средней вирулентности и 0,5–1 мл – слабовирулентными.
1.11.9. Определениесерогрупповой принадлежности культур лептоспир проводят в соответствии сНаставлением по применению групповых агглютинирующих лептоспирозных сывороток,утвержденным Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 31 мая 1974 г.
1.11.10. Вкачестве биологической модели для обнаружения лептоспир могут быть использованывзрослые кролики и морские свинки. Кровь животных исследуют по РМА на наличиеспецифических антител. Животных, в крови которых не обнаружены специфическиеантитела, заражают исследуемым материалом.
Кровьзараженных животных исследуют три раза через каждые семь дней по реакциимикроагглютинации начиная с разведения 1: 10 с лептоспирами 13 серологическихгрупп. Обнаружение в крови зараженных животных специфических антителсвидетельствует о наличии лептоспир в исследуемом материале и позволяеториентировочно судить о их серогрупповой принадлежности.
2. Бактериологическоеисследование воды
2.1. Водаявляется основным фактором в передаче возбудителя лептоспироза.
Лептоспиробнаруживают в воде биологической пробой на крольчатах, свинках, хомяках,’крапчатых сусликах, взрослых кроликах, используя одну из следующих методик.
2.2. Пробыводы объемом 1–2 л берут в стерильную посуду, подогревают до 30° ивыливают в эмалированный кювет, – помещают в него на один час двух подопытных животных.кожа брюшка или задние ноги которых скарифицированы, так чтобыскарифицированная поверхность была погружена в воду. Начиная с четвертого дня укрупных зверьков (крольчата, морские свинки) берут кровь из сердца с цельювыделения гемокультур, исследуют микроскопически брюшной экссудат. Одного измелких зверьков убивают. На 14–20-й день всех выживших животных также убивают.Патологический материал исследуют на наличие лептоспир. Кровь исследуют на РМА.
2.3. Пробу воды(до 500 мл) центрифугируют при 10–15 тыс. об/мин в течение 30 – минут, сливаютнадосадочную жидкость, а осадки из всех центрифужных стаканов суспензируют встерильной – питательной среде для лептоспир или физиологическом растворе.Суспензию вводят внутрибрюшинно или подкожно хомякам по 0,5–1 мл, крольчатам иморским свинкам по 1–2 мл. В дальнейшем исследуют, как указано в п. 2.2.
2.4. Полученныйпосле центрифугирования осадок подкожно вводят в дозе 2–3 мл взрослым кроликам,не имеющим в крови лептоспирозных антител,
Через 7–14 и20 дней кровь кролика исследуют по РМА с лептоспирами 13 серологических групп.Обнаружение специфических антител в титре 1: 10 и выше свидетельствует оналичии лептоспир в исследуемой пробе воды.
3.Импрегнация гистологических срезов из органов серебром по левадити
3.1. Материаломдля гистологического исследования служат кусочки коркового слоя почек и печенитолщиной не более 1 см, консервированные 10%-ным раствором формалина.
Лептоспирыудается обнаружить с наибольшим постоянством в гистологических срезахимпрегнированных серебром по Левадити. Методы Крантца, Полагута и Майера менееэффективны.
3.2 Несколькокусочков органов не толще 1 см, лучше 2–’3 мм, фиксируют в 10%-ном водномрастворе нейтрального формалина 24–48 часов. После фиксации кусочки переносят в96° спирт на 24 часа. Промывают в дистиллированной воде до тех пор, покакусочки не осядут на дно бюкса (не менее 2–3 часов), воду меняют три раза.
3.3. Помещаюткусочки в 1–3%-ный раствор азотнокислого серебра на 3–6 дней. Процесссеребрения ведут при температуре 37 °С. Раствор азотнокислого серебраготовят на свежей дистиллированной воде из расчета 15 мл раствора на одинкусочек.
3.4. Прополаскиваютв дистиллированной воде в течение 2–5 минут. После промывки кусочки переносят внебольшую порцию редуцирующей смеси в отдельной чашечке на 2 минуты (растворбыстро темнеет) и затем помещают их в приготовленный перед употреблениемосновной редуцирующий раствор следующего состава: пирогалловая кислота – 4 г,дистиллированная вода – 100 мл, формалин чистый – 5 мл.
Растворготовят из расчета 20–25 мл на один кусочек ткани. Восстановление обязательнопроводят в банке из темного стекла.
3.5. Кусочкивыдерживают в редуцирующей смеси 24–48 часов при комнатной температуре в темномместе или в банке из темного стекла.
Времявыдержки контролируют приготовлением единичных срезов через каждые 12–16 часовво избежание передержания, так как срезы могут стать черными. Промывают вдистиллированной воде 1–2 часа.
3.6. Обрабатываютпрепараты последовательно спиртами: в 96° спирт (спирт 1) на сутки; в 96° спирт(спирт 2) на сутки; в 96° спирт (спирт 3) – на сутки; спирт-метил (спиртыэтиловый и метилсалициловый поровну) – до опускания кусочков на дно бюкса, азатем в метилсалициловый – до утра.
3.7. Послеэтого перекладывают в кашу-парафин (ксилол и парафин поровну) на 30 минут при57°; парафин 1 – на 60 минут при 57 °С; парафин 2 – на 60 минут при 57 °С.
Из быстроостуженного парафина вырезают блок с кусочком органа и наклеивают на деревянныйкубик. Приготавливают тонкие срезы на санном микротоме и наклеивают напредметное стекло, депарафинируют в трех бюксах с ксилолом по 10–15 минут вкаждом и заключают под покровное стекло в канадский бальзам, подсушивают ипросматривают под микроскопом со светлопольным конденсором при увеличении 90X7–10.
В случаенеудовлетворительных результатов импрегнации лептоспир готовят препараты издругих одновременно приготовленных блоков. Препараты необходимо хранить втемноте.
3.8. Микрокартина:лептоспиры черные, окружающая ткань буровато-желтая. Лептоспиры располагаютсяна поверхности эпителия и в просветах мочевых канальцев почек, несколько реже –в цитоплазме эпителия, преимущественно группами. После импрегнации серебромтипичные лептоспиры имеют S-образную с 1–2 изгибами или змеевидную форму сгрубыми, толстыми завитками, которые в отдельных случаях слабо заметны. Иногдав просвете и на поверхности эпителия мочевых канальцев встречаютсяаргирофильные гранулы (окрашены в цвет лептоспир), ‘которые при отсутствии типичныхформ нельзя принимать за лептоспир.
4. Серологическаядиагностика лептоспироза
4.1.Серологическая диагностика лептоспироза основана на обнаружении специфическихантител в крови животных, реакцией микроагглютинации (РМА) или реакцией микроагглютинации(РА).
4.2.Сыворотку крови животных исследуют на лепто-спироз по РМА или РА для выясненияблагополучия хозяйства по этому заболеванию и установления диагноза налептоспироз у отдельных животных.
В последнемслучае проводят 2–3-кратное исследование. Кровь берут для исследования на 5–7-йдень болезни и повторно через 7–10 дней.
4.1. Порядокпостановки и учета реакции микроагглютинации (РМА)
4.1.1. Дляпостановки реакции микроагглютинации необходимы:
– исследуемаясыворотка крови животных;
– антигены– культуры диагностических штаммов лептоспир;
– электролит– физиологический раствор;
– микроскоп,конденсор темного поля и осветитель те же, что для микроскопическойдиагностики;
– агглютинационныепластинки или пробирки Флоринского;
– 40–100-гнездныештативы;
– бактериологическиепробирки;
– градуированныепипетки на 1, 2, 5 и 10 мл;
– аппаратФлоринокого;
– предметныестекла.
4.1.2.Исследуемая сыворотка. Для исследования пригодна сыворотка свежая,замороженная, высушенная на фильтровальной бумаге, консервированная фенолом илиборной кислотой. Консервируют отстоявшуюся сыворотку, слитую в сухие стерильныепробирки.
Добавляют 5%-ныйраствор фенола при постоянном помешивании 0,05 мл (1 капля) на каждый миллилитрсыворотки.
Борнуюкислоту вносят в сыворотку до получения насыщенного раствора и образования надне пробирки небольшого осадка кристаллов. Кристаллы кислоты не должны попадатьв пипетку во время постановки реакции.
Высушиваютсыворотку на квадратах (5X5 см)’ белой фильтровальной бумаги по 3–5 капель(0,05 мл каждая) при комнатной температуре или в термостате при температуре 37 °С. Консервированныепробы сыворотки пригодны для исследования в течение месяца. Гемолизированные,загнившие, плесневелые и проросшие сыворотки не исследуют.
4.1.3.Антигены. В качестве антигенов в РМА используют живые культуры лептоспирразличных серологических групп. Республиканские лаборатории ставят реакцию слептоспирами 13 серологических групп: Icterohaemorrhagiae, Javanica, Canicola,Pyrogenes, Cynoptery, Autumnalis, Pomona, Grippotyphosa, Hebdomadis, Tarassovi,Bataviae, Australis, Ballum.
Краевые,областные, межрайонные лаборатории исследуют сыворотку домашних животных сантигенами 6 серогрупп: Grippotyphosa, Pomona, Icterohaemorrhagiae, Tarassovi,Hebdomadis, Canicola.
Сывороткукрови диких животных исследуют с лептоспирами 13–15 серогрупп.
В РМАиспользуют эталонные штаммы лептоспир или их аналоги, рекомендованныеВсесоюзным государственным научно-контрольным институтом ветеринарныхпрепаратов МСХ СССР.
Диагностическиештаммы лептоспир лаборатории получают во Всесоюзном государственномнаучно-контрольном институте ветеринарных препаратов МСХ СССР, и поддерживаютих периодическими пересевами через каждые 10 -15 дней.
Пригодностькультуры для использования в реакции оценивают путем просмотра пробирок впроходящем свете и микроскопией.
Придостаточном накоплении лептоспир после встряхивания пробирки с культурой впроходящем свете в среде хорошо заметны муаровые волны, а в спокойном состояниилегкая опалесценция. Наличие осадка, пленки, помутнения среды свидетельствует опрорастании культуры посторонней микрофлорой, полная прозрачность среды – оботсутствии лептоспир.
В реакциииспользуют чистые культуры лептоспир в возрасте 5–15 дней без признаковагглютинации и лизиса (четкообразные, неподвижные клетки) с накоплением 70–100микробных клеток в поле зрения микроскопа при увеличении 20X10X1,5 или 40X7–10.Культуры, содержащие 150–200 и более лептоспир в поле зрения микроскопа,разводят перед постановкой реакции питательной средой или физиологическимраствором до указанной концентрации.
Каждоеразведение сыворотки разливают в отдельный ряд, состоящий из 5–13 лунок(пробирок) в зависимости от количества антигенов, используемых в реакции.Каждую культуру-антиген вносят по 0,1 мл в три лунки с разными разведениямисыворотки. После добавления антигенов пластины встряхивают и выдерживают втермостате при температуре 30 °С в течение часа.
Контролемслужит смесь культуры лептоспир с физиологическим раствором по 0,1 мл.Лептоспиры в контроле должны оставаться подвижными, не иметь признаков лизиса иагглютинации.
4.1.8.Реакцию учитывают путем микроскопии капель из каждой лунки в темном полемикроскопа при увеличении 20X10 или 20X7X1,5. Капли из лунок выносят напредметное стекло бактериологической петлей от большего разведения к меньшему ипросматривают их без покровного стекла. Капли можно наносить двумя способами:1) бактериологической петлей диаметром 3 мм наносят на стекло сразу до 30капель и затем просматривают их под микроскопом; 2) бактериологической петлейдиаметром 1 мм наносят на предметное стекло в освещенный центр поля зренияодну каплю и просматривают ее, передвигают столик на 2–3 мм и рядом спервой наносят и учитывают вторую каплю. В этом случае на одном предметномстекле учитывают 60–80 капель.
После каждогоантигена петлю прокаливают и охлаждают.
4.1.9. Результатыреакции оценивают в крестах по четырехбалльной системе:
+ + + +агглютинированы100% лептоспир;
+ + + – агглютинированы75% лептоспир;
+ + – – агглютинированы50% лептоспир;
+ – – – агглютинированы25% лептоспир;
– (знакминус) агглютинация отсутствует. Агглютинация проявляется в склеиваниилептоспир и образовании паучков. Паучок включает от 3–5 до нескольких десяткови даже сотен лептоспир. Свободные концы лептоспир сохраняют подвижность.
В начальныхразведениях сыворотки может наблюдаться лизис лептоопир, проявляющийся внабухании и обездвиживании, появлении зернистости и полного распада микробныхклеток.
4.1.10.Положительной считают реакцию, оцененную не менее чем на два креста, приотсутствии агглютинации в ‘контроле.
При повторномисследовании сыворотки крови реакцию ставят в тех же разведениях.
4.2. Порядокпостановки и учета реакции макроагглютинации (РА)
Реакциюмакроагглютинации ставят и учитывают в соответствии с Временным наставлением поприменению антигенов для диагностики лептоспироза у животных реакциеймакроагглютинации, утвержденным Главным управлением ветеринарии Министерствасельского хозяйства СССР 12 мая 1974 года.
4.3. Оценкапоказаний РМА и РА
4.3.1.Животных с титром сыворотки в РМА 1: 100 или реагирующих по РА на 1–2 креста,кроме лошадей и крупного рогатого скота, реагирующих с лептоспирами группыHebdomadis, считают подозреваемыми в заражении.
Крупныйрогатый скот, реагирующий с лептоспирами группы Hebdomadis, и лошадей,реагирующих с лептоспирами любой серологической группы, считают подозреваемымив заражении при титре антител в РМА 1: 500 или реагирующих в РА на 1–2 креста снеразведенной сывороткой.
Кровь отживотных, подозреваемых в заражении, и от животных, не реагировавших при первомисследовании, повторно проверяют через 7–10 дней.
4.3.2. Выявлениеантител у животных, не реагировавших при первом исследовании, или нарастаниетитра у реагировавших в РМА в пять и более раз, или положительная РА на 3–4креста свидетельствуют об активном инфекционном процессе у обследуемыхживотных.
4.3.3. Животных(кроме лошадей и реагирующего с лептоспирами группы Hebdomadis крупногорогатого скота) с титром сыворотки в РМА 1: 500 и более или в РА на 3–4 крестаи крупный рогатый скот, реагирующий с лептоспирами группы Hebdomadis и лошадей,реагирующих с лептоспирами любой серогруппы при титре в РМА 1:2500 и более илив РА на 3–4 креста, рассматривают как возможных лептоспироносителей.
4.3.4.Возбудителями лептоспироза при серологической диагностике считают лептоспир тойсерологической группы, к которой обнаружены антитела в наиболее высоком титре.
Необходимоучитывать, что в сыворотке крови свиней, крупного рогатого и мелкого рогатогоскота и лошадей при исследовании по РМА обнаруживают в 5 – 15% случаев (изчисла положительно реагирующих) антитела в наиболее высоком титре к лептоспирамAustralis, Autumnalis, Ballum, Pyrogenes, Cynoptery, Bataviae, которые не быливыделены ни в одном случае от сельскохозяйственных животных.
Такие реакцииследует рассматривать как межгрупповые, являющиеся следствием зараженияживотных лептоспирами Pomona, Tarassovi и другими, обычно выделяемыми отсельскохозяйственных животных.
ЛептоспирыAustralis, Bataviae, Autumnalis, Ballum, Pyrogenes, Cynoptery, Kazachstanicaмогут быть признаны возбудителями лептоспироза у сельскохозяйственных животныхтолько после выделения этих лептоспир в чистой культуре или подтверждении ихроли реакцией иммуноабсорбции.
4.4. Методикапостановки реакции иммуноабсорбции при исследовании проб сыворотки
4.4.1. Вреакции иммуноабсорбции изучают пробы сыворотки животных, агглютинирующиелептоспиры нескольких серологических групп в равно высоких титрах или имеющиенаиболее высокий титр – по отношению к лептоспирам, ранее не известным вкачестве возбудителя лептоспироза у сельскохозяйственных животных.
4.4.2. Дляпроведения абсорбции выращивают в 0,2 – 0,5 – литровых флаконах все штаммылептоспир, с которыми данная проба сыворотки дала реакцию агглютинации. К 5–7-суточнымкультурам добавляют 0,3% формалина и выдерживают 10–12 часов. Затем лептоспирыосаждают центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 30 минут. Сливают надосадочнуюжидкость, а осадок суспензируют в объеме 0,9 мл среды или физиологическогораствора, 0,1 мл исследуемой сыворотки смешивают с 0,9 мл концентрированногоантигена и выдерживают в течение 48 часов при температуре 1–5 °С. Абсорбированнуюсыворотку проверяют в РМА на наличие остаточных антител к штамму-абсорбенту, азатем исследуют с лептоспирами групп, с которыми реагировала сыворотка доабсорбции.
4.4.3. Впроцессе абсорбции лептоспиры, являющиеся возбудителем инфекции у данной особи,извлекают из сыворотки антитела к лептоспирам всех других серологических групп,в то время как антитела к штамму-возбудителю болезни не абсорбируются изсыворотки гетерологичными типами лептоспир.
Длясокращения объема работы сыворотку можно в начале абсорбировать лептоспирами,являющимися наиболее частыми возбудителями болезни у животных данного вида.
4.4.4. Оценкаэпизоотической ситуации в хозяйстве по результатам лабораторных исследованийприведена в Инструкции о мероприятиях по борьбе с лептоспирозом животных пп. 2.4.,2.5. и 2.6.Серологическая группа Серологический вариант Типовой штамм Icterohae-morrhagiae icterohaemorrhagiae copenhageni mankarso naa’m mwogolo dakota sarmin birkini smithi ndambari ndahambukuje budapest weaveri RGA M-20 Mankarso Naam Mwogolo Grand River Sarmin Birkin Smith Ndambari Ndahambukuje PV-1 GZ-390-U Javanica javanica poi sorex-jalna coxi sofia Veldrat Batavia 46 Poi Sorex Jalna Cox Sofia 874 Celledoni celledoni whitcombi Celledoni Whitcombi Canicola canicola bafani kamituga jonsis sumneri broomi bindjei schnueffneri benjamin malaya Hond Utrecht IV Bafani Kamituga Jones Sumner Patane Bindjei Vleermuise 90-C Benjamin H-6 Ballum ballum castellonis arboreae MUS-127 Castellon-3 Arboreae Pyrogenes pyrogenes Zanoni myocastoris abramis biggis hamptoni alexi robinsoni rnanilae Salinem Zanoni LSU-1551 Abraham Biggs Hampton HS-616 Robinson LT-398 Cynopteri cynopteri canalzoniae butembo 3522-C Cz-188k Butembo Autumnalis autumnalis rachmati fortbragg sumatrana bulgarica bangkinang erinaceiauriti mooris sentot louisiana Orleans djasiman gurungi Akiyama A Rachmat Fort Bragg Sapulette Nikolaevo Bangkinang-1 Erinaceus auritus 670 Moores Sentot LSU-1945 LSU-2580 Djasiman Gurung Australis australis lora muenchen jalna bratislava fugis bangkok peruviana pina nicaragua Ballico Lora Munchen C-90 Jalna Jez Bratislava Fudge Bangkok D-92 Lt-941 LT-932 Lt-990 Pomona pomona kennewieni monjakov mozdok tropika proechimys Pomona Lt-1026 Monjakov 5621 CZ-299U LT-796 Grippotypho-sa grippotyphosa valbuzzi Moskva-V Valbuzzi Hebdomadis hebdomadis nona kambale kremastos worsfoldi jules maru borincana kabura mini Nebdomadis Nona Kambale Kremastos Worsfold Jules CZ-285– В HS-622 Kabura Sari Hebdomadis
szwajizak georgia perameles wolffi
hardjo recreo medanensis trinidad seiroe balcanica polonica nero haemolytica ricardi Szwajizak LT-117 Bandicoot-343 3705 Hardjoprajitno LT-957 Hond-HC LT-1098 M-84 1627 Burgas 493-Poland Qamsulin March Richardson Bataviae
bataviae
paidjan djatzi kobbe balboa claytoni brasiliensis Van Tienen Paidjan HS-26 CZ-320-K LT-761 LT-818 LT-996 Tarassovi tarassovi bakeri atlantae guidae kisuba bravo atchafalaya chagres rama gatuni Perepelicin LT-79 LT-81 RP-29 Kisuba Bravo LSU-1013 LT-924 LT-955 LT-839 Panama panama CZ-214-K Sherman! shermani LT-821 Semaranga semaranga patoc sao-paulo Veldrat Semarang-173 Patoc I Sao Paulo Andamana andamana CH-11