–PAGE_BREAK–3.2 Физико – химические методы анализа
3.2.1 Оптические методы
Основаны на взаимодействии со светом. Свет является проникающими электромагнитными колебаниями и поэтому взаимодействует с анализируемой системой. Под воздействием электромагнитных волн в атомах вещества, через которое проходит свет, возникают вынужденные колебания электронов и ядер, они смещаются относительно друг друга, и атомы приобретают наведенные диполи. Диполи, в свою очередь, генерируют вторичные волны, взаимодействие которых со светом приводит к изменению оптических свойств анализируемой системы. В оптических методах анализа используется связь между свето-поглощением, светорассеянием, преломлением света, вращением плоскости поляризации плоскополяризован-ного света, вторичным свечением вещества — и ее составом. К таким методам, например, относятся:
1) абсорбционные методы анализа;
2) поляриметрия;
3) рефрактометрия.
Адсорбционные методы анализа. Эти методы основаны на поглощении света атомами и молекулами анализируемых веществ. Электромагнитное излучение имеет двойственную природу. Некоторые явления (дифракция, преломление) объясняются волновой природой излучения. С другой стороны, поглощение, эмиссия говорят о том, что электромагнитное излучение — поток материальных частиц фотонов или квантов. Волны электромагнитного излучения, характеризуются длиной волны или частотой колебаний (число колебаний в единицу времени), которые связаны между собой соотношением:
Kv= c,(1)
где к — длина волны; v— частота; с — скорость света
Энергия электромагнитного излучения связана с его частотой соотношением:
E=hv,(2)
где Е — энергия фотона; v— частота; h— постоянная Планка.
В 1960г. XIГенеральная конференция по мерам и весам в качестве единицы измерения длины волны в фотометрическом анализе приняла нанометр (нм): 1 нм= 10 -9м; 1 нм = 10 -7см = 10 А = 1 мкм.
С целью анализа используются методы, при которых светопоглощение измеряют в интервале длины волны от 200 до 20 000 нм. Область, составляющая диапазон 190—400 нм, называют ультрафиолетовой частью спектра (УФ). Участок спектра в пределах 400—760 нм называется видимой частью спектра, или видимым светом, а участок длин волн 760—20 000 нм — инфракрасной областью спектра (ИК). В ИК-области спектра единицей измерения длины волн служит микрометр (1 мкм = 10~6 м). Очень часто инфракрасное излучение характеризуется волновым числом v= \/Х, (где Xвыражено в сантиметрах, размеренность v— соответственно в обратных сантиметрах (см1). В зависимости от вида поглощающих частиц и способа трансформирования избыточной энергии возбуждения различают:
1) атомно-абсорбционный анализ, основанный на поглощении световой энергии атомами анализируемых веществ;
2) молекулярный абсорбционный анализ, основанный на поглощении световой энергии молекулами анализируемых веществ;
3)анализ, основанный на измерении световой энергии, поглощенной или рассеянной частицами анализируемых веществ.
3.2.2 Электрохимические методы
Электрохимические методы относятся к физико-химическим и основаны на измерении и регистрации электрических параметров анализируемых систем (лекарственных веществ).
К электрохимическим методам относятся потенциометрия, полярография, амперометрическое титрование, электрофорез.
Рассмотрим из этих методов электрофорез. Электрофорез — метод анализа, основанный на способности заряженных частиц к передвижению во внешнем электрическом поле. Задача электрофореза заключается в определении скорости миграции частиц смеси к электродам. При условии, что расстояние между электродами достаточно велико, разницу в скоростях движения индивидуальных частиц можно использовать для разделения смесей.
Передвижение частиц при электрофорезе зависит от ряда факторов, основными из которых являются: напряженность электрического поля, величина электрического заряда, скорость и размер частицы, вязкость, рН и температура среды, продолжительность электрофореза. Определяется величина электрофоретической подвижности, характерной для данного вещества. Различают абсолютную и относительную электрофоретическую подвижность. Абсолютная измеряется в сантиметрах в секунду под влиянием градиента потенциала 1 В на 1 см и выражается в см2 В”1-с”1. Относительная электрофоретическая подвижность есть отношение подвижности исследуемого вещества к подвижности другого вещества, принятого за стандарт.
Существуют два метода электрофореза:
— фронтальный, который проводят в свободной незакрепленной среде в кювете;
— зональный электрофорез в закрепленной среде.
Они имеют единую аппаратурную схему: источник тока, камеру для электрофореза, два электрода, соединяющих камеру с источником тока, и приспособления для сбора и идентификации разделенных веществ.
Примерная схема проведения, электрофореза: подготовка среды (носителя); нанесение веществ, подлежащих разделению; проведение электрофореза; обнаружение и количественная оценка разделенных веществ.
Большинство электрофоретических измерений в настоящее время выполняют методом зонального электрофореза, при проведении которого миграция заряженных частиц происходит в стабилизирующей среде, которая удерживает частицы после выключения тока в виде отдельных зон. Для обнаружения разделяемых компонентов стабилизирующую среду (фильтровальная бумага, крахмал, агар-агар и др.) обрабатывают подходящими фотометрическими реагентами.
Метод используется для разделения простых и комплексных неорганических ионов, органических веществ (аминокислоты, нуклеотидов), макромолекулы (например, белков в сыворотке).
3.2.3 Хроматографический метод
Хроматографией называется процесс разделения смесей веществ, основанный на количественном различии в поведении разделяемых компонентов при их непрерывном перераспределении между двумя фазами, одна из которых неподвижна, а другая имеет постоянное направление движения.
По механизму, лежащему в основе разделения, различают адсорбционную, распределительную, ионообменную и некоторые другие виды хроматографии.
В адсорбционной хроматографии используется явление адсорбции, происходящее на поверхности сорбента. Исследуемую смесь, растворенную в подходящем растворителе, пропускают через стеклянную колонку, заполненную адсорбентом (силикагелем, оксидом алюминия, полиамидом и др.). Составные части смеси, имеющие различную адсорбцию, распределяются в разных участках сорбента. В верхней части колонки будет находиться наиболее адсорбированное вещество, в нижней — менее адсорбированное. Вещества, адсорбированные на колонки, вымываются растворителями (элюирование) и определяются в отдельных фракциях элюата химическими, физическими или физико-химическими методами анализа.
В адсорбционной хроматографии используют жидкую и газообразную подвижные фазы, в соответствии с этим различают жидкостную и газовую хроматографию.
В распределительной хроматографии компоненты смеси распределяются на твердом носителе (силикагеле, крахмале, окиси алюминия, фильтровальной бумаге и др.) между подвижной и неподвижной фазами в зависимости от растворимости компонентов в этих фазах.
Неподвижной фазой чаще всего является вода, адсорбируемая из воздуха поверхностью носителя. Подвижная фаза — органические растворители или их смеси — медленно перемещается по поверхности носителя под действием либо капиллярных сил, либо силы тяжести, либо адсорбционных сил.
Если в качестве носителя служит фильтровальная бумага, то этот способ распределения компонентов смеси называется хромонографией на бумаге.
Если носителем является тонкий слой закрепленного сорбента (пластинки «Силуфол») или незакрепленного сорбента на стекле, то этот вид распределения веществ называется хроматографией в тонком слое сорбента.
Для проведения хроматографии на бумаге или в тонком слое сорбента используют хроматографические камеры подходящего размера. На дно камеры наливают подвижную фазу в количестве, достаточном для образования слоя толщиной 0,5 см, камеру закрывают и выдерживают для насыщения парами растворителей 30—60 мин. Стенки камеры для насыщения обкладывают фильтровальной бумагой. Анализируемый раствор наносят микропипеткой или микрошприцем на линию старта, проведенную на расстоянии 2—3 см от нижнего Края пластинки (или бумаги), так, чтобы пятна образцов отстояли один от другого и от краев слоя сорбента не менее чем на 2 см.
После окончательного высыхания нанесенных на линию старта пятен пластинку вносят в камеру. Нижний край пластинки (или бумаги) должен погрузиться в подвижную фазу на 0,5—1 см. Пластинки с закрепленным слоем сорбента располагают под углом 60—90°, а с незакрепленным слоем сорбента под углом 15—20° к поверхности жидкости. Когда фронт растворителя пройдет 1.0— 15см, пластинку вынимают, отмечают положение фронта. Пятна веществ на хроматограммах обнаруживают при просмотре в видимом или ультрафиолетовом свете. При необходимости хроматограмму предварительно проявляют (погружением или опрыскиванием) раствором реактива, дающего цветные реакции с хроматографируемыми веществами.
Для обнаруженных пятен вычисляют величину Rfпо уравнению:
Rf= a/b,
где а — расстояние от линии старта до центра пятна; b— расстояние от линии старта до фронта подвижной фазы.
Этот вид хроматографии применяется в фармацевтическом анализе для идентификации лекарственных веществ, определения их чистоты, количественного анализа.
В основе ионообменной хроматографии лежит обратимая хемосорбция ионов анализируемого раствора ионогенными группами сорбента. Обратимый обмен ионами в системе сорбент — растворитель происходит стехиометрически.
В зависимости от характера ионогенных групп ионообменные сорбенты делятся на катионообменные (катиониты) и анионообменные (аниониты).Микромолекулы катионитов содержат кислотные группы различной силы, такие, как сульфогруппы —SO3H, карбоксильные —СООН и другие, которые при взаимодействии с солями обменивают ион водорода на другие катионы: RH+ NaCl= RNa+ НС1.
Микромолекулы анионитов имеют в своем составе основные группы, например, алифатические и ароматические аминогруппы различной степени замещенности (вплоть до четвертичных). В ОН-форме аниониты способны к обмену с солями на анионы кислот.
ROH+ NaCl= RC1 + NaOH
Применение ионитов для целей анализа возможно как в солевых, так и в Н- и ОН-формах. Ионит предварительно готовят к работе: 2—3 раза промывают водой. Катионит заливают разведенной хлористоводородной кислотой и выдерживают при периодическом перемешивании 12ч, после чего отмывают водой до отрицательной реакции на хлорид.
Для перевода анионита в основную форму его замачивают вначале разведенной хлористоводородной кислотой на 12ч, отмывают до отрицательной реакции на хлорид и заливают 5 %-ным раствором карбоната натрия или 2 %-ным раствором едкого натра на 2ч, периодически перемешивая. Затем ионит промывают, водой и сливают в колонку.
Хроматографическая колонка представляет собой стеклянную трубку, снабженную краном. В нижнюю часть колонки впаивается пористая стеклянная пластинка или помещается тампон ваты Суспензию ионита с водой наливают в колонку через воронку; предварительно колонку на три четверти заполняют водой, а при сливании суспензии кран открывают и дают жидкости медленно сливаться из колонки. Зерна ионита быстро оседают. При заполнении колонки не следует допускать попадания воздуха между зернами ионита. Слой сорбента в колонке должен быть 8—10см. Поверх сорбента помещают тампон из промытой водой ваты. Над ватным тампоном должен быть слой воды не менее 1—1,5см. Как правило, возможно многократное использование ионообменной хроматографической колонки. Однако после 6—8-кратного использования колонку нужно регенерировать. Для этого через колонку с катеонитом пропускают 4 %-ный раствор хлористоводородной кислоты, а через раствор с анионитом—5 %-ный раствор карбоната натрия или 2 %-ный раствор едкого натра. По окончании процесса, когда концентрация регенерирующего раствора на входе и выходе из колонки становится равной, колонки промывают водой до нейтральной реакции. Способом ионообменной хроматографии можно количественно определять соли алкалоидов минеральных и органических кислот
Анализируемый раствор помещают в хроматографическую колонку сверху, пропускают с определенной скоростью, собирая элюат в колбу для титрования. После этого через колонку пропускают воду, не допуская попадания воздуха между зерен сорбента. Кран колонки закрывают тогда, когда среда вытекаемого элюата станет нейтральной. Собранную жидкость титруют указанным в методике титрованным раствором.
Например:
Определение 5 %-ного растворов цитрата натрия. 2мл исследуемого раствора разбавляют 8 мл воды. Полученный раствор переносят в колонку с катеонитом КУ-2 в Н-форме. Жидкости дают стекать со скоростью 20—25 капель в минуту Колонку промывают свежепрокипяченной охлажденной водой (40—50мл) до нейтральной реакции на метиловый оранжевый.
Собранные в одну колбу фильтрат и промывные воды титруют 0,1 М раствором едкого натра в присутствии фенолфталеина до розового окрашивания жидкости. 1 мл 0,1 М раствора едкого натра соответствует 0,011 цитрата натрия.
Определение некоторых солей. Применяя катеонит СДВ-3 можно определять многие лекарственные препараты, являющиеся солями. К ним относятся:
1) соли алкалоидов (гидрохлорид хинина, гидрохлорид сальсолина, гидрохлорид папаверина, гидрохлорид эфедрина);
2)соли неорганических кислот (йодид калия, хлорид натрия, хлорид аммония, хлорид кальция);
3)соли органических кислот (бензоат натрия, салицилат натрия, гидротартрат калия).
Точную навеску соли (около 0,05—0,1) растворяют в 5—10 мл воды и пропускают через колонку с катионами СДВ-3 со скоростью вытекания 30 капель в минуту. Затем катионит промывают водой до нейтральной реакции промывных вод на лакмус; в фильтрате кислоту титруют 0,1 М раствором едкого натра до желтого окрашивания раствора при индикаторе метиловом оранжевом. Одну и ту же колонку можно использовать 10— 12 раз без регенерации.
3.3 Физические методы анализа
3.3.1 Определение температуры плавления и температурного интервала плавления
Определение температуры плавления и температурного интервала плавления Температурный интервал плавления вещества — интервал между скорректированной температурой, при которой вещество начинает спадаться или образовывать капли на стенках капиллярной трубки, и скорректированной температурой, при которой вещество полностью переходит в расплавленное состояние, о чем свидетельствует исчезновение твердой фазы.
Указание в статье «температурный интервал плавления a— b, означает, что температурный интервал плавления, определенный методом, описанным ниже, должен находиться в этих пределах. Температура плавления вещества — скорректированная температура, при которой вещество полностью расплавлено, о чем свидетельствует исчезновение твердой фазы.
Прибор:
Подходящий прибор для определения состоит из стеклянного сосуда с соответствующей жидкостью, контролируемого источника тепла, термометра, капиллярной трубки и увеличительного стекла.
Стеклянный сосуд должен иметь подходящую конструкцию, содержать соответствующую жидкость и быть снабжен устройством для быстрого перемешивания жидкости (для этого подходят некоторые жидкие силиконы). Контролируемый источник тепла должен обеспечивать подъем температуры жилкой нагреваемом среды с требуемой скоростью.
Стандартизованные термометры должны иметь интервал определения от — 10 до +360°С при длине одного деления на шкале не менее 0,8 мм. Желательно использовать стеклянные ртутные термометры с твердым столбиком и резервуаром цилиндрической формы, выполненные из специального стекла, подходящего для данного интервала температур; каждый термометр должен быть снабжен защитной трубкой.
Термометры, используемые для определения температуры плавления, могут быть от калиброваны для полного или частичного погружения. Термометр для полного погружения — это термометр, показания которого будут правильными, если термометр погружен по крайней мере до конца столбика ртути в среду, температуру которой необходимо измерить. Термометр для частичного погружения — термометр, показания которого будут правильными, если термометр погружен на предписанную глубину и выступающий столбик ртути находится в предписанных условиях. Если термометры для полного погружения используются для частичного погружения, необходим вспомогательный термометр для определения поправки на выступающий столбик ртути. Выступающие над поверхностью нагреваемого материала части этих термометров должны быть заключены в стеклянную трубку.
Капиллярная трубка из боросиликатного стекла, закрытая с одного конца, должна иметь следующие размеры: толщина стенки около 0,10—0,15 мм; длина, подходящая для применяемого прибора; внутренний диаметр 0,9—1,1 мм.
Для наблюдения за капиллярной трубкой требуется подходящее увеличительное стекло. Может быть использован любой другой прибор и метод, обеспечивающие такую же точность определения и откалиброванные по методу Международной фармокопеи при помощи стандартных образцов ВОЗ для определения точки плавления.
3.3.2 Определение точки плавления жиров, восков и т. п.
Точка плавления жиров, восков и т. п. — это скорректированная температура, при которой столбик вещества в капилляре становится прозрачным или внезапно поднимается, если определение приводят описанным ниже методом.
Прибор:
Используют прибор, аналогичный описанному в разделе 3.1. для определения точки плавления и температуры плавления измельчаемых веществ, внося следующие изменения;
— в сосуде для нагревания используют воду;
— точно стандартизованный термометр должен охватывать интервал от —10 до + 100 СС;
— стеклянная капиллярная трубка должна иметь те же размеры, что и трубка, описанная в разделе 3.1., но оба ее конца должны быть открыты; можно использовать капиллярные трубки из мягкого стекла.
3.3.3 Определение точки затвердевания
Точка затвердевания жидкости или расплавленного твердого вещества — это наивысшая температура, при которой оно затвердевает. Точка затвердевания жидкости та же, что и точка плавления твердого вещества, но, так как жидкость может быть охлаждена до температуры ниже точки затвердевания без образования твердой фазы, для определения точки затвердевания жидкости или расплавленного твердого вещества.
Прибор:
Подходящий прибор состоит из пробирки с внутренним диаметром около 2 см и длинной около 10 см, вставленной при помощи корковой пробки в большую по размерам пробирку диаметром около 3 см и длиной 12 см, сосуда с водой или другой охлаждающей смесью и точно стандартизованного термометра.
3.3.4 Определенна точки кипения
Точка кипения жидкости — это скорректированная температура, при которой жидкость кипит при нормальном атмосферном давлении, если определение проводят описанным ниже методом.
Прибор:
Подходящий прибор для определения состоит из сосуда с соответствующей жидкостью, источника тепла и термометра, описанного в разделе Л для определения точки плавления и температуры плавления измельчаемых веществ; необходима также тонкостенная стеклянная пробирка с наружным диаметром около 4 мм и длиной, подходящей для применяемого прибора» а также тонкостенная стеклянная капиллярная трубка с внутренним диаметром не более 1 мм, которая заплавлена с одного конца на 2 мм.
3.3.5 Определение показателя приломления
Показатель преломления вещества — отношение скорости распространения света в вакууме к скорости его распространения в испытуемом веществе. Этот показатель изменяется в зависимости от длины волны света, используемого при измерении, и температуры, поэтому необходимо указывать эти условия. На практике обычно удобно измерять преломление по отношению к атмосферному воздуху и веществу, а не к вакууму и веществу, так как дляфармакопейных целей это не оказывает существенного влияния на наблюдаемые величины.
Показатель преломления может быть также определен как отношение синуса угла падения к синусу угла преломления. Измерение показателя преломления используется в фармокопейных целях в основном для установления подлинности жидких веществ. Он может также использоваться для испытания чистоты таких веществ.
Показатель преломления обычно выражают в безразмерных единицах при длине волны 589,3 нм (D-линия спектра натрия) при температуре 20±0.5°С.
Точность измерения должна соответствовать требованиям статьи. Для фармакопейных целей обычно достаточно выражать показатель преломления до трех десятичных знаков.
Прибор:
Имеющиеся в продаже приборы обычно сконструированы для использования дневного света, но они калибруются для выражения показателя преломления в безразмерных единицах при длине волны 580,3 нм (D-линии спектра натрия).
Оптические части прибора должны сохраняться абсолютно чистыми. Рабочие поверхности призм не должны иметь царапин.
Помимо соблюдения приведенных выше указаний, следует выполнять инструкции изготовителя в отношении соответствующего источника света.
Прибор калибруют по отношению к стандарту, поставляемому изготовителем; постоянный температурный контроль испытуемой жидкости и проверка чистоты призм осуществляется путем определения показателя преломления дистиллированной воды, который равен 1,3330 при 20°С и 1,3325 при 25°С.
продолжение
–PAGE_BREAK–