«Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина»

На правах рукописиХУРАНОВАлан МухадиновичЦИТОЛОГИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА СОСТОЯНИЯ ОРГАНОВ РАЗМНОЖЕНИЯ У КОРОВ ДО- И ПОСЛЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ06.02.06. – ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животныхАВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наукМосква – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМ и Б).^ Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессорПанков Борис ГригорьевичОфициальные оппоненты: доктор биологических наук, профессорПорфирьев Иван Арсентьевич доктор ветеринарных наук^ Дюльгер Георгий ПетровичВедущая организация: ФГОУ ВПО «Самарская государственная сельскохозяйственная академия».Защита состоится «___»____2011 г. в «___» часов на заседании диссертационного совета Д. 220.042.05 в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23, тел. (495) 377-93-83.С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» Автореферат разослан «___» декабря 2010 года и размещен на сайте http://mgavm.ru/Ученый секретарь диссертационного совета Волчкова Л.А.^ 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность исследования. Для интенсивного развития животноводства необходимо базироваться не только на использовании экономических законов, но и на современных знаниях биологических закономерностей, составляющих основы развития живых организмов, их физиологических функций (Шкис П.Л., 1987; Чернюс Ю.Л., Петров В.А., Костенко В.Ф., 1991; Кузьмин Р.Г., 2000). Успешному воспроизводству крупного рогатого скота и снижению его продуктивности в значительной степени способствуют акушерско-гинекологические заболевания, яловость коров и телок, наносящие большой экономический ущерб хозяйству из-за недополучения приплода, снижения продуктивности, дополнительных затрат на лечение и преждевременной выбраковки животных. Предпосылки к послеродовым осложнениям возникают у животных во время стельности, но чаще всего при родах и в послеродовой период (Гончаров В.П., 1990). Повышения процента плодотворно осемененных коров в первые две половые охоты, можно добиться только регулярным проведением ранней диагностики состояния органов размножения начиная с отела до плодотворного осеменения. Своевременное выявление коров, больных субинволюцией матки, клиническими и скрытыми формами эндометрита и эффективное их лечение в стадию уравновешивания полового цикла позволяет увеличивать количество плодотворно осемененных коров в первые две после отела половые охоты и снизить процент эмбриональной смертности. При проведении цитологических исследований маточных выделений ученые не придавали значения токсическому фактору и не выводился процент гнойных телец. Не были разработаны цитологические критерии прогнозирования течения беременности, диагностики эмбриональной смертности, скрытых и неполных абортов у многоплодных животных, ранней дифференциальной диагностики токсических и скрыто протекающих процессов в матке коров. Не были разработаны четкие критерии диагностики патологических процессов по их локализации. В связи с этим наше внимание было обращено именно к данным проблемам.^ Цель и задачи исследований. Основными целями исследований являлись: разработка метода цитологической диагностики беременности с учетом количества гнойных телец в мазке маточной слизи и выведение двух критериев: тканевого индекса и токсического фактора, повышение процента оплодотворяемости коров в первые две послеродовые половые охоты, а также экспресс-диагностика состояния органов размножения акушерской ложкой Б.Г. Панкова (АЛП) в послеродовой период, фармакопрофилактика и лечение послеродовых заболеваний у коров суспензией ФЛЭКС-2, для повышения процента плодотворно осемененных коров в первые два после отела половых цикла. Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить цитограммы в пробах, взятых АЛП из влагалища стельных коров. 2. Провести оценку диагностической точности (значимости) цитоморфологического и гормонального (ИФА) методов, с целью определения стельности. 3. Изучить значение экспресс-диагностики акушерской ложкой Панкова Б.Г. и влияние фармакопрофилактики послеродовых осложнений у коров, внутриматочным введением суспензии ФЛЭКС-2 в сочетании с миотропным препаратом «Гетеротон», на снижение послеродовых заболеваний, снижения эмбриональной смертности у коров в послеродовой период. 4. Изучить цитоморфологические изменения в половых органах коров на 6-й, 9-й, 12-й, 15-й и 19…21-й дни после отела, а также в стадию уравновешивания полового цикла между второй и третьей половыми охотами при проведении фармакопрофилактики послеродовых осложнений. 5. Определить показатели тканевого индекса и токсического фактора по мазкам из проб маточных выделений у коров в послеродовой период при патологических процессах. 6. Определить ассоциацию условно-патогенной микрофлоры в маточных выделениях (экссудате) коров, больных эндометритами. 7. Определить спектр антимикробной активности лекарственного средства – суспензии «ФЛЭКС-2», используемого для фармакопрофилактики и лечения эндометритов у коров подопытной группы.^ Научная новизна. Впервые реализована идея Б.Г. Панкова проводить цитологическую диагностику стельности по мазкам проб, взятых АЛП, по наличию только клеток влагалищного эпителия и слизистых клеток пробки беременности, при отсутствии эпителиальных клеток других отделов гениталий; Установлен факт начального процесса эмбриональной смертности по появлению в мазках эпителиальных клеток шейки и рогов матки повторными цитологическими исследованиями, проводимыми через 21…35 дней после установления беременности цитологическим, гормональным и ректальным методами. Появление эпителиальных клеток тела и рогов матки свидетельствует о гибели зародыша, эмбриона, которые будут рассасываться или изгоняться; Многократные цитологические исследования мазков из проб маточных и влагалищных выделений от коров, находящихся в послеродовом периоде, взятых АЛП, позволили, составить цитограммы, свойственные конкретным физиологическим и патологическим процессам в гениталиях; Установлено, что при наличии в мазках из маточных выделений фагоцитоза, отсутствии нейтрофилов и гнойных телец, и если акушерская ложка входит во влагалище только на половину длины стержня, значит коровы клинически здоровые, инволюция матки завершена. Такие животные плодотворно осеменяются в первые две после отела половые охоты; Установлено, что отсутствие фагоцитоза, гнойных телец при наличии нейтрофилов свидетельствует о наличии токсического состояния в среде эндометрия. Таких животных осеменять нельзя, т.к. уже созданы условия для эмбриональной смертности, многократных неплодотворных осеменений.^ Практическая значимость результатов исследований заключается в повышении оплодотворяемости коров в первые две послеродовые половые охоты, а также быстрота и высокая достоверность цитоморфологического метода диагностики состояния органов размножения и проведения фармакопрофилактики задержания последа, послеродовых заболеваний. Результаты наших исследований показывают, что в опытной группе был снижен процент коров с послеродовыми осложнениями по сравнению с контрольной: в опытной группе коров, было выявлено больных субинволюцией матки – 20 %, с клиническим и скрытым эндометритами – 30 % и 20 %, а в контрольной группе данные показатели были – у 90 %, 80 %, 70 % коров соответственно. Материалы исследований используются в учебном процессе в Кабардино-Балкарской государственной сельскохозяйственной академии им. В.М. Кокова, Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина студентами ветеринарных факультетов при изучении дисциплины «Ветеринарное акушерство, гинекология и биотехника репродукции животных».^ Апробация результатов исследований. Основные результаты диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов ФГОУ ВПО МГАВМ и Б (2008…2010 гг.); на всероссийском семинаре «Опыт создания и работы сервисных центров по воспроизводству сельскохозяйственных животных в рамках реализации Государственной программы развития сельского хозяйства», 2009 г., Дубровицы.^ Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, в т.ч. 2 статьи – в материалах Всероссийских, региональных и республиканских научных конференций и 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.^ Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждений полученных результатов, выводов, данных о практических использованиях научных результатов, рекомендаций по использованию научных выводов, списка использованной литературы (210 источников, в т.ч. 39 иностранных авторов) и приложений. Работа иллюстрирована 43 таблицами и схемами, и 36 рисунками и фотографиями.^ Основные положения, выносимые на защиту: 1. Разработка цитоморфологического метода для диагностики стельности, как более достоверного, по сравнению с гормональным; 2. Определение диагностической значимости процентного соотношения эпителиальных клеток, нейтрофилов и гнойных телец в мазках из маточных выделений при заболевании коров клиническими и скрытыми эндометритами, субинволюции матки, при стельности и эмбриональной смертности, при стельности в сочетании с вагинитом. 3. Определение эффективности цитоморфологической диагностики состояния половых органов коров в послеродовой период, стельности и эмбриональной смертности; 4. Определение значения тканевого индекса и токсического фактора в цитограммах мазков из маточных выделений для оценки «норма – патология» в гениталиях коров в послеродовой период.^ СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ2. Материалы и методы исследованияИсследования по теме диссертации проводились с 2007 по 2010 гг. на кафедрах акушерства, гинекологии и биотехники репродукции животных, в лабораториях кафедр радиобиологии и микробиологии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина и в МТФ «Бессоново» Воскресенского района Московской области, учебном хозяйстве МГАВМ и Б им. К.И. Скрябина. Под наблюдением в период научных исследований находились коровы черно-пестрой породы с удоем 3200 кг молока за лактацию. Доение, кормление, снабжение водой и уборка навоза механизированы. Животные регулярно подвергались ветеринарно-санитарному осмотру и профилактическим ветеринарным исследованиям и вакцинациям. Объектом исследования служили 20 коров. Из них были сформированы две группы: подопытная и контрольная, по 10 голов в каждой. Животных подбирали по принципу аналогов. Предметом исследования были пробы маточных выделений. Для разработки экспресс-метода морфологической дифференциальной диагностики состояния органов размножения после отела, а также фармакопрофилактики послеродовых заболеваний (субинволюции матки, клинических и скрытых эндометритов) у коров, нами были использованы несколько методов исследования. В основу экспресс-метода морфологической дифференциальной диагностики нормально протекающей беременности и эмбриональной смертности (ЭС) нами был взят анализ мазка, полученный из пробы маточных выделений. Для получения мазка образец маточно-влагалищных выделений помещался на предметное стекло, смешивался стеклянной палочкой с несколькими каплями физиологического раствора. При смешивании сгусток слизи отмывался от включений и примесей, а из жидкой части брали каплю смыва для приготовления мазка. Мазок высушивали, фиксировали и окрашивали по методу Романовского. Приготовленный мазок изучали под микроскопом. Проводился подсчет в каждом мазке 100 клеток (эпителиальные клетки влагалища, шейки, тела и рогов матки, яйцепроводов, лимфоциты, нейтрофилы, гнойные тельца, фагоцитоз). Затем выводилось 2 критерия – ТИ и ТФ, характеризующих норму или патологию в половых органах по цитограммам. ТИ – тканевой индекс – это частное от деления числа соматических клеток (эпителиальных, покровных, секреторных) на число клеток белой крови; ТФ – токсический фактор – это число от деления процента гнойных телец на суммарный процент остальных клеток в мазке. Для каждого физиологического состояния и воспалительного процесса характерны конкретные ТИ и ТФ. Мазки маточных выделений приготавливали на 6, 9, 12, 15, 19 – 21, на 60-ый дни после отела, у коров опытной и контрольной группы. Всего приготовлено и изучено 150 мазков. С целью снижения случаев возникновения послеродовых заболеваний в подопытной группе была применена схема ранней диагностики, фармакопрофилактики и лечения послеродовых осложнений у коров. С целью профилактики и лечения клинических и скрытых эндометритов применялась суспензия «ФЛЭКС-2». Определение уровня гормона прогестерона в молоке проводилось в лаборатории кафедры радиобиологии МГАВМ и Б им. К.И. Скрябина. Пробы молока были взяты у коров подопытной и контрольной групп на 19-ый и 24-ый дни после осеменения. Определение прогестерона было основано на использовании конкурентного иммуноферментного анализа. Бактериологическое исследование проводилось на кафедре микробиологии ФГОУ ВПО МГАВМ и Б. Патологический материал поступил из учебного хозяйства ФГОУ ВПО МГАВМ и Б МТФ «Бессоново». У больных эндометритом коров АЛП брали маточную слизь-экссудат для определения контаминации пробы микроорганизмами. В опытной и контрольной группах применялся метод ректальной диагностики состояния органов размножения у коров в норме и при патологических состояниях, а также диагностика стельности на 90-ый день после отела. Биометрическая обработка полученных результатов по определению стельности через уровень концентрации прогестерона в молоке, и количественный показатель эпителиальных клеток влагалища в приготовленных из маточной слизи мазков проводилась на кафедре математики и информатики ФГОУ ВПО МГАВМ и Б, с помощью однофакторного дисперсионного анализа (критерий Фишера) и двух выборочного t-теста с одинаковыми дисперсиями (критерий Стьюдента). Обработка проводилась с помощью анализа данных табличного процессора MS Excel.^ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙЦитограммы маточных выделений у коров в послеродовой период Для изучения мониторинга цитограмм, брали пробы маточных выделений и приготавливали мазки на 6, 9, 12, 15, 19-21 дни после отела и в стадию уравновешивания полового цикла между второй и третьей половыми охотами. Подсчитывали 100 соматических клеток и клеток белой крови. Были составлены таблицы для каждого мазка (всего 150 таблиц). В таблицах было отражено 9 видов клеток: эпителиальные влагалищные (Влаг); шейки (ШМ), тела (ТМ) и рогов матки (РМ); яйцепроводов (Япр); лимфоциты (ЛФЦ); нейтрофилы (Неф); гнойные тельца (ГТ); фагоцитирующиеся эпителиальные клетки (ФКл), затем выводили тканевой индекс (Тк. И.) и токсический фактор (Т.Ф.). Результаты цитологических исследований мазков от коров подопытной группы приведены в таблицах № 3…12, а контрольной группы в таблицах № 13…22. Таблица 1.^ Клеточный состав маточной слизи, взятой из влагалища акушерской ложкой Панкова, у коровы опытной группы № 1 вид кл Влаг ШМ ТМ РМ Япр ЛФЦ Неф ГТ ФКл ТкИ ТФ дни 6 20 11 23 3 0 3 30 9 1 1,73 0,1 9 16 10 7 2 0 1 46 12 6 0,75 0,14 12 11 7 4 1 0 0 53 21 3 0,43 0,27 15 10 2 4 0 0 0 65 17 2 0,25 0,2 19-21 19 16 13 5 1 2 38 4 2 1,35 0,04 м\у 2-3 ох 89 3 0 0 0 0 2 3 3 46 0,03 Таблица 2.^ Клеточный состав маточной слизи, взятой из влагалищ