Содержание Введение 1. Основные компоненты молока 2. Методы анализа аминокислот 1. Хроматографический метод анализа 2. Спектрофотометрический метод анализа 3. Титрометрический метод анализа 4. Электрохимический метод анализа 3.Методы определения аминокислотного состава 1. Определение аминокислот методом тонкослойной хроматографии 3.2.
Определение аминокислот спектрофотометрическим методом 4. Обзор реферативных журналов Список использованной литературы Введение Проблема питания является одной из важнейших социальных проблем. Жизнь человека, его здоровье и труд невозможны без полноценной пищи. Согласно теории сбалансированного питания в рационе человека должны содержаться не только белки, жиры
и углеводы в необходимом количестве, но и такие вещества, как незаменимые аминокислоты, витамины, минералы в определенных, выгодных для человека пропорциях. В организации правильного питания первостепенная роль отводится молочным продуктам. Это в полной мере относится к молоку, питательная ценность которого обусловлена высокой концентрацией в нем молочного белка и жира, наличием незаменимых аминокислот, солей кальция и фосфора, так необходимых для нормального развития организма человека.
Легкая усвояемость — одно из наиболее важных свойств молока как продукта питания. Более того, молоко стимулирует усвоение питательных веществ других пищевых продуктов. Молоко вносит разнообразие в питание, улучшает вкус других продуктов, обладает лечебно-профилактическими свойствами. В молоке содержится более 120 различных компонентов, в том числе 20 аминокислот, 64 жирные кислоты, 40 минеральных веществ, 15 витаминов, десятки ферментов и т.д.
Энергетическая ценность 1 л сырого молока составляет 2797 кДж. Один Литр молока удовлетворяет суточную потребность взрослого человека в жире, кальции, фосфоре, на 53% — потребность в белке, на 35% — в витаминах А, С и тиамине, на 26% — в энергии.[1] Основная цель данной курсовой работы – выявить аминокислотный состав молока. 1. Основные компоненты молока Молоко — это продукт нормальной секреции молочной железы коровы.
С физико-химических позиций молоко представляет собой сложную полидисперсную систему, в которой дисперсионной средой является вода, а дисперсной фазой — вещества, находящиеся в молекулярном, коллоидном и эмульсионном состоянии. Молочный сахар и минеральные соли образуют молекулярные и ионные растворы. Белки находятся в растворенном (альбумин и глобулин) и коллоидном (казеин) состоянии, молочный жир — в виде эмульсии. Состав молока непостоянен и зависит от породы и возраста коровы, условий кормления
и содержания, уровня продуктивности и способа доения, периода лактации и других факторов. Период лактации у коров длится 10-11 мес, в течение этого времени от коров получают доброкачественное молоко. Компоненты молока делят на истинные и посторонние, а истинные — на основные и второстепенные исходя из их содержания в молоке (рис. 5.1). Такие основные компоненты, как молочный жир, лактоза, казенны, лактоальбунин, лактоглобулин, являются соединениями, которые синтезируются в молочной железе и встречаются
только в молоке. При производстве, оценке состава и качества молока принято выделять содержание жировой фазы и молочной плазмы (все остальные компоненты, кроме жира). С технологической и экономической точек зрения молоко можно разделить на воду и сухое вещество, в которое входит молочный жир и сухой обезжиренный молочный остаток (СОМО) (рис. 5.2). Наибольший удельный вес в молоке занимает вода (более 85%, на остальные компоненты, входящие
в состав сухих веществ или сухих остатков, приходится 11-14%). Содержание так называемого сухого обезжиренного остатка молока (СОМО) составляет 8-9%. Его определяют по ГОСТ 3626-73 методом высушивания навески молока при 102 + 2% до постоянной массы. Его можно найти расчетным путем — сложением содержания СОМО и количества жира в молоке. Для этого содержание
СОМО определяют по формуле, используя показатели жирности и плотности молока. Сухой остаток включает все питательные вещества молока. Он определяет выход готовой продукции при производстве молочных продуктов.[2] 2. Методы анализа аминокислот В настоящее время существует ряд методов количественного определения аминокислот в молоке и пищевых продуктах. Из всего многообразия методов количественного определения аминокислот
в различных объектах, можно выделить четыре основные группы: хроматографические, спектрофотометрические, титриметрические и электрохимические методы анализа.[1] 1. Хроматографический метод анализа Хроматография в настоящее время является наиболее широко используемым аналитическим методом. Она активно применяется для научных исследований, анализа показателей качества и безопасности пищевых продуктов. Исследуя разнообразие сложных смесей, хроматография выполняет одну
из важнейших задач химической науки: точное и подробное изучение состава. Быстрое развитие хроматографических методов на практике позволило существенно расширить возможности использования хроматографии для анализа практически всех веществ: газообразных, жидких, твердых. Наиболее активное применение методов хроматографии для анализа пищевых продуктов началось с развития приборной базы, появления доступного оборудования, особенно отечественного производства.
Решение задачи продовольственной безопасности дало определенный стимул к развитию и совершенствованию хроматографических методов исследований для целей анализа состава и определения биологической ценности пищевых продуктов, а также количественного измерения содержания в них различных контаминантов и токсичных веществ. Важные особенности хроматографических методов анализа – высокая селективность, большая чувствительность и универсальность. Многие методики выполнения измерений являются универсальными, применимыми для широкого
спектра исследований, что позволяет занимать ведущее место среди инструментальных методов анализа сложных многокомпонентных смесей. Значительно расширилось применение методов хроматографического анализа для исследований молока и продуктов его переработки. Хроматография – физический метод анализа и исследования веществ и их смесей, основанный на разделении компонентов в динамическом режиме за счет распределения их при перемещении между неподвижной фазой и потоком подвижной фазы.
Все хроматографические методы подразделяют на группы в зависимости от типа сорбционного процесса. Сорбция – поглощение газов, паров или растворенных веществ жидкими или твердыми сорбентами. Существует несколько разновидностей сорбции: адсорбция, хемосорбция и капиллярная конденсация. Хроматографические методы подразделяют на группы в зависимости от типа сорбционного процесса, при этом сорбент может быть твердым или жидким, а анализируемая смесь – газообразной или жидкой.
В зависимости от применения сорбента, условий поведения анализа и приборной базы можно использовать различные виды хроматографии для анализа широкого спектра веществ.[3] Классификацию хроматографических методов можно представить следующим образом: по агрегатному состоянию смеси, в котором проводятся ее разделение на компоненты газовая, жидкостная и газожидкостная хроматография; по механизму процесса разделения смесей – адсорбционная, распределительная, ионообменная, осадочная,
окислительно-восстановительная, абсорбционно-комплексообразовательная хроматография; по форме проведения хроматографического процесса – колоночная, капиллярная, плоскостная (бумажная, тонкослойная и мембранная). Разделение веществ может происходить и в результате нескольких одновременно действующих механизмов. Это приводит к образованию хроматограмм смешанного типа, однако один из процессов всегда является доминирующим. Степень применения для анализа пищевых продуктов разных методов хроматографии отражена на рис.
1. Метод газовой хроматографии (ГХ) применяется наиболее широко. С его помощью определяют жирнокислотньй и триглицеридный состав пищевых продуктов, различные виды пестицидов, гербицидов и инсектицидов, ароматические и полиароматические соединения, проводят анализ спиртов и спиртосодержащей продукции, образцов воздуха и промышленных газов, лекарственных препаратов. Преимущества метода газовой хроматографии: простота проведения измерений, он идеален для анализа газовых
проб, возможность использования широкого спектра хроматографических колонок и детекторов, большое количество методических материалов; недостатки: неприменим для анализа высокомолекулярных соединений, не используется для соединений, которые имеют высокую температуру кипения, требуется тщательная пробоподготовка исследуемого объекта, очень ограниченно применим для образцов, содержащих воду, и т.д.[4] Довольно значительно количество стандартизованных методик выполнения измерений (МВИ) с применением метода
ГХ привело к его широкому использованию (44 % относительно других видов методов хроматографии). Данное обстоятельство свидетельствует и о хорошем развитии отечественного приборостроения, так как на рынке доминирующее положение занимает отечественное аналитическое оборудование. В настоящее время разработан проект стандарта на определение аминокислот в молоке и молочных продуктах методом газовой хроматографии. Метод основан на количественном определении триптофана при разделении
на хроматографической колонне в газовой фазе с применением пламенно – ионизационного детектора. Стандарт позволит количественно проводить измерения аминокислоты триптофана в молочных продуктах, так как данная аминокислота относится к незаменимым аминокислотам и необходим, для нормального функционирования организма. Одним из наиболее перспективных методов является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) он находит широкое применение для анализа пищевых продуктов, измерения внесенных ингредиентов,
пищевых добавок, консервантов и красителей, определения витаминов и аминокислот, высокомолекулярных соединений и белков, а также для идентификации значительного количества объектов. Преимущества метода: простота, возможность анализа молекулярно – массового распределения, использования широкого спектра хроматографических колонок и детекторов, широкий выбор модулей позволяет гибко решать любые аналитические задачи при постоянном прецизионном контроле всех частей системы документированием
их работоспособности. К недостаткам ВЭЖХ можно отнести: ограниченное применение для объектов с высоким значением рН, а также для ионогегенных и сильнополярных соединений; несколько ограниченная эффективность разделения; тщательная пробоподготовка объекта для исследования. Но преимущества метода значительно перекрывают его недостатки. Подготовлен проект стандарта на определение консервантов и красителей методом
ВЭЖХ, который позволяет проводить измерение консервантов ( бензоиной, сорбиновой, пропионовой кислоты и их солей) и синтетических красителей ( индигокармина, желтого «Солнечный закат», тартразина, понсо 4R, изорубина и т.д.). Метод основан на экстракции консервантов и красителей анализируемой пробы и их количественном определении с помощью ВЭЖХ с применением обращенофазовой колонки и спектрофотометрического детектора. Этот стандарт значительно расширит возможности применения хроматографических методов для контроля качества
молока и продуктов его переработки, позволит проводить измерения содержания консервантов и красителей в продуктах переработки молока. На рис. 2 представлена хроматограмма стандартной смеси из пяти красителей, наиболее часто применяемых в пищевой промышленности. Хроматограмма получена с применением ВЭЖХ с защитной колонкой длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненной обращенофазовым сорбентом с привитыми октадецильными группами размером частиц 5 мкм;
колонка длиной 125 мм, внутренним диаметром 4 мм. На хроматограмме видно, что по времени удерживания красители распределяются следующим образом: индигокармин, желтый «Солнечный закат», изорубин, тартразин и понсо 4R. Данное обстоятельство позволяет с хорошей воспроизводимостью определять содержание красителей в молочных составных и молокосодержащих продуктах, а также проводить четкое дифференцирование и идентификацию продуктов
переработки молока по составу и биологической ценности. Метод ВЭЖХ применяется для определения лизина и цистеина в молоке, молочных продуктах и продуктах детского питания на молочной основе. Методическая база представлена методическими указаниями (МУК 4.1.2420-08) и разрабатываемым совместно IDF и ISO стандартом NC 34/SC № 744. Данные методики характеризуются практически сходными процедурами проведения измерений, но несколько
отличаются по пределам обнаружения лизина и цистеина (для РФ – 1 мг/кг, для IDF и ISO -0,5 мг/кг). Эффективность метода ВЭЖХ подтверждается большим набором статистических данных, полученных в испытательных лабораториях разных стран мира. Хорошие возможности ВЭЖХ по точности и прецизионности получены в результате применения стандартных образцов анализируемых веществ. Хроматографию, реализующую ионообменный механизм разделения в сочетании
с кондуктометрическим детектированием разделяемых компонентов, принято называть ионной хроматографией (ИХ). Это аналитический метод с комбинацией ионообменных колонок с детектированием по электропроводности. На практике применяют два различных метода: с химической супрессией, которая предполагает химическое подавление фоновой проводимости; прямой хроматографии (ионная хроматография с электронным подавлением фона), в которой используются элюенты с низкой концентрацией солей органических кислот на ионообменниках
с очень низкой емкостью. Ионная хроматография сегодня в мире является арбитражным методом анализа при исследовании состава неорганических анионов водных растворов. Обладая поистине фантастической воспроизводимостью (например, анализ семи основных неорганических анионов F С Вг NO2 NO3 НРО4 SO4- возможен менее чем за 10 мин), ИХ отличается минимальной инструментальной погрешностью и высокой воспроизводимостью результатов.
Метод ИХ широко используется для экологического мониторинга питьевой и сточной воды, количественного анализа примесных ионов контроля сырья и готовых продуктов в пищевой промышленности, анализа требуемых по рецептуре ионов и т.д. Методы ионной хроматографии практически не применяют для анализа молочных продуктов, что, вероятнее всего, связано с особенностью ионной хроматографии, которая основана на свойстве подвижных ионов сорбента вступать в обменные реакции с ионами обмывающего раствора.
Сложная молочная матрица приводит к невозможности разделения ионов в анализируемой смеси и влиянию различных факторов на протекание процесса хроматографирования. Тонкослойная хроматография (ТСХ) – наиболее широко распространенный метод разделения сложных смесей в аналитической практике. Принцип разделения основан на перераспределении компонентов между подвижной фазой и слоем адсорбента, нанесенным на носитель (стеклянную пластину, фольгу).
В качестве сорбента чаще всего используется силикагель, в том числе с модифицированной поверхностью. Детектирование осуществляется визуально (качественный анализ), для количественного анализа используются спектрофотометры ультрафиолетовой и видимой области. Идентификация пробы осуществляется с использованием эталонных веществ. Особенности применения ТСХ – легкая совместимость с другими методами (ВЭЖХ-
ВЭТСХ, ВЭТСХ-МС и т.п.), широкий выбор готовых аппликаций по различным областям применения: от анализа пищевых продуктов до экологического контроля. Применение тонкослойной хроматографии для контроля показателей безопасности в молоке и продуктах его переработки несколько снижается. На данный период стандартизован метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) по определению афлатоксина М1 в молоке и молочных продуктах, сорбиновой кислоты и ее солей, бензойной кисоты и ее
солей в пищевых продуктах. Но при наличии более перспективных методов измерений данных параметров необходимость оценки с применением ВЭТСХ отпадает. Этот метод хорошо зарекомендовал себя в фармакопейной промышленности как рутинный метод анализа фармацевтических препаратов и сырья на содержание основного вещества, примесей и побочных веществ. Газожидкостная хроматография (ГЖХ) – разделение газовой смеси вследствие различной растворимости компонентов пробы в жидкости или различной стабильности образующихся комплексов.
Неподвижной фазой служит жидкость, нанесенная на инертный носитель, подвижной – газ. Применяется для анализа различных компонентов и соединений. В молочной промышленности метод ГЖХ нашел применение для идентификации жировой фазы продукта. ГОСТ Р 51471-99 «Жир молочный. Метод обнаружения газожидкостной хроматографией стеринов» позволяет определять стерины в выделенном из продукта жире. Метод подразумевает оценку хроматограммы и количественное
определение стеринов (фитостеринов в продукте с содержанием растительных жиров и холестерина в продукте с содержанием животных жиров). Метод ГЖХ эффективен при разделении сложных органических, металлоорганических и биохимических систем (метод разделения). Кроме того, его можно использовать для завершения химического анализа. В этом случае время или объем удерживания используют для качественной идентификации, а высота или площадь пика дает количественную информацию (в сущности данное обстоятельство использовано в
ГОСТ Р 51471). Качественная идентификация компонента основана на величине промежутка времени от момента ввода пробы до момента записи вершины пика; количественные данные получают, вычисляя площадь пика. Введение в практику исследований открытых капиллярных колонок с пористым слоем позволило существенно увеличить разрешающую способность ГЖХ, что позволило применять этот метод для измерения стероидных гормонов, предварительной очистки препаратов и разделения смеси на классы.[5]
Возможности совместного использования хроматографии и других видов инструментального анализа все больше расширяются. Например, при применении хроматомасс-спектрометрии и газовой хроматографии появилась очевидная возможность измерения диоксинов, дибензофуранов и т.д. С использованием МС-детектора. Соединение метода электрофореза и хроматографии (электрофоретическая хроматография) позволяет определять распределение смеси в соответствии с их абсорбционной способностью
и подвижностью в электрическом поле. По экспертным оценкам, хроматография относится к 20 выдающимся открытиям XX столетия, которые преобразовали науку, а через нее определили и развитие промышленности. Hи один аналитический метод не может конкурировать с хроматографией по универсальности применения и эффективности разделения самых сложных) многокомпонентных смесей. На современных газохроматографических капиллярных колонках в одном эксперименте могут быть разделены
более 1000 индивидуальных компонентов (например, в бензиновых фракциях нефти); двумерный электрофорез позволяет увидеть до 2000 белков в биологических объектах или аминокислот в гидролизатах белков [6]. Только благодаря сочетанию разнообразных методов хроматографии и капиллярного электрофореза стали возможными расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК и завершение работ по программе «Геном человека». Используя хроматографию, можно определить содержание супертоксикантов, в частности полихлорированных
диоксинон в объектах окружающей среды крайне низких концентрациях этих веществ (менее 1 мкг/кг). Развитие хроматографических методов анализа расширило возможности исследования молока и молочных продуктов, позволило проводить измерения по широкому перечню параметров, что послужило предпосылкой к разработке и совершенствованию методов анализ. 2.2. Спектрофотометрический метод анализа Спектрофотометрические методы основаны на способности аминокислот или продуктов их взаимодействия с
определенными реагентами поглощать в УФ-области спектра. Эта группа методов наиболее широко используется в настоящее время для количественного анализа аминокислот.[3] Растворы ароматических аминокислот (триптофана, фенилаланина, тиро-зина) поглощают в диапазоне 240–300 нм. На этом основании разработаны экспресс-методы их количественного определения, отличающиеся простотой. Однако, вследствие того, что максимумы светопоглощения этих аминокислот близки, то в процессе количественного
определения отдельных ароматических аминокислот возможны ошибки анализа. Поэтому, в большинстве случаев, данный метод анализа является предварительным и требует дополнительного анализа с помощью ВЭЖХ, ГЖХ и аминокислотных анализаторов. Разработан простой и точный спектрофотометрический метод анализа цистина (примеси цистеина в пищевых продуктах и молоке), основанный на способности его солянокислых растворов к светопоглощению при длине
волны 250 нм. При изучении аналитических возможностей метода, установлено, что цистеин в это области не поглощает и не мешает определению цистина.[4] Учитывая важную биологическую роль цистеина (участие в реакциях трансаминирования, обмене серы в организме, в частности, в тканях хрусталика), разработка доступных методов его определения является важной аналитической задачей. Так, разработана методика количественной оценки цистеина в биологических жидкостях, основанная на его
окислительно-восстановительной реакции с солями железа (III) в присутствии 1,10-фенантролина с последующим спектрофотометрическим определением продукта реакции. Методика характеризуется высокой точностью определения и простотой исполнения С целью определения суммарного содержания аминокислот в молоке был разработан спектрофотометрический метод количественной оценки продукта реакции аминокислот с альдегидом ортофталевым.
Продукт реакции определяют спектрофотометрически в присутствии меркаптоэтанола при длине волны 340 нм. Метод характеризуется высокой чувствительностью и позволяет количественно определить все аминокислоты, за исключением цистина, пролина.[3] 2.3. Титрометрический метод анализа Из титриметрических методов количественного определения наиболее широко используется титрование в неводных растворителях. Аминокислоты относятся к веществам, титрование которых в воде затруднено из-за слабых
кислотно-основных свойств и/или малой растворимости. Аминокислоты растворяют в кислоте уксусной ледяной, и полученный раствор титруют 0,1 М раствором кислоты хлорной. Титрование может быть проведено с индикатором (кристаллический фиолетовый), так и потенциометрически с использованием стеклянного электрода в качестве индикаторного. Параллельно проводят контрольный опыт. Методика анализа характеризуется высокой точностью определения,
не требует использования дорогостоящего оборудования. Однако данный метод имеет ряд существенных недостатков: использование агрессивных, высокотоксичных реагентов. Для приготовления титранта используют ангидрид кислоты уксусной, оборот которого в РФ ограничен; длительность приготовления титранта (0,1М раствора кислоты хлорной – более 48 ч). Для количественного анализа отдельных аминокислот используют также метод
Кьельдаля, кислотно-основное и йодометрическое титрование.[5] 2.4. Электрохимический метод анализа. В последние десятилетия все более широкое распространение получили электрохимические методы анализа аминокислот (особенно полярографические, потенциометрические и вольтамперометрические), вследствие высокой точности определения и производительности. Следует отметить, что эти методы, как правило, являются строго специфичными, т.е. в оптимизированных
условиях они позволяют определить лишь отдельные аминокислоты (например, полярографию используют для анализа аминокислот или продуктов их взаимодействия, способных к восстановлению или окислению на микроэлектродах). Так, разработан способ полярографического определения триптофана, основанный на электрохимическом восстановлении продуктов его взаимодействия с формальдегидом. Предложена доступная методика полярографического количественного определения метионина в молоке и кисломолочных продуктах, основанная на способности метионина к окислению.
[5] 3.Методы определения аминокислотного состава 3.1. Определение аминокислот методом тонкослойной хроматографии Пробу белка предварительно гидролизуют. Хроматографируют гидролизат, растворенный в этаноле. Разделение аминокислот ведут в буферных растворах на Витмане №3 или на пленках с ионообменным слоем. Оба сорбента подвергаются специальной обработке: пленку
на 3 ч погружают в цитратный буферный раствор (0,004 М цитрат натрия рН = 3,2), затем высушивают при комнатной температуре. Капли пробы и стандартных аминокислот наносят на стартовую линию на пленке, помещают в хроматогграфическую камеру (почти вертикально), на дно которой налит буферный раствор, подогретый до 50ºС. Через заданное время пленку вынимают, сушат, опрыскивают проявителем (нингидрином), определяют
Rf и после обработки растворителем фотометрируют при 570 нм. Методика На стартовую линию пластинки наносят 2 (10) мкл гидролизата пробы, а слева и справа на расстоянии 2 см (от места ввода пробы) – столько же стандартного раствора аминокислоты (0,1%- ный раствор смесиаминокислот: аргинина, лизина, гистидина, фенилаланина, тирозина, лейцина, изолейцина, метионина, валина, пролина, аланина, глицина, глутаминовой кислоты, треонина, серина и аспарагиновой кислоты в 0,01М
HCl). Через 10 минут пленку помещают в ХГ камеру с нитратным буфером (буферный раствор рН=3,3. В 1 литре дистиллированной воды растворяют 84 г моногидрата лимонной кислоты, 16 г NaOH, 5,9 мл HCl ρ = 1,19), так чтобы уровень жидкости был ниже линии старта. Через 2 ч, когда фронт растворителя достигнет верхнего края пленки, ее вынимают, сушат в течение 9 минут при 105 ºС, опрыскивают раствором нингидрина (проявитель.
К 0,2 г нингидрина в 95 мл метанола добавляют 5 мл 2,4,6 – коллидина), выдерживают 10 минут при 105 ºС. Пятна можно стабилизировать ацетатом кадмия, затем высушить 5 минут при той же температуре. 3.2.Определение аминокислот спектрофотометрическим методом Аминокислоты, первичные амины, полипептиды и пептоны при нагревании с нингидрином образуют синие или сине – фиолетовые продукты. Реакция протекает сложно с окислением, восстановлением, декарбоксилированием,
дезаминированием: Окраска и выход продукта зависят от свойств аминокислоты (табл. 1.1). При добавлении CdCl2 образуется комплекс кадмия с фиолетовым Рузмана λmax=530 нм. 0,2 – 3 %-ный раствор нингидрина готовят в разных растворителях (изобутаноле, ледяной уксусной кослоте, метилцеллозольве, воде). Приведем несколбко методик. Таблица 1.1 λmax и диапазон определяемых концентраций аминокислот
по реакции с нингидрином Аминокислота λmax, нм Определяемые концентрации, мкг/мл Аланин 550 0,1 – 0,8 Аргинин 560 0,2 – 1,0 Аспарагин 550 0,2 – 1,8 Валин 560 0,1 – 1,0 Глицин 555 0,1 – 0,8 Изолейцин 565 0,2 – 1,2 Лейцин 555 0,1 – 1,0 Лизин 545 0,05 – 0,5 Метионин 560 0,1 – 1,0 Норвалин 560 0,1 – 1,0
Треонин 550 0,2 – 1,3 Триптофан 550 0,2 – 2,0 Фенилаланин 550 0,1 – 1,4 Методика 1 Пробу аминокислоты 1,0 мл (содержащую примерно 5 мкг/мл) в 80 %- ном этаноле смешивают с 2мл 0,2 % – ного нингидрина в изобутаноле в мерной колбе емкостью 10,00 мл. Доводят объем растворителя до метки изобутанолом, перемешивают, нагревают на водяной бане при 80ºС в течение трех минут, охлаждают до комнатной температуры.
Измеряют поглощение Ах при λmax (см. табл.1.1). Процедуру повторяют со стандартным раствором аминокислоты измеряют Аст. Из отношения Ах: Аст оптических плотностей находят концентрацию аминокислоты в исследуемом растворе. С учетом разбавления раствора вычисляют содержание ее в пробе. Методика 2 К 1,0 мл раствора пробы прибавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты и 1 мл 2,5 % – ного раствора
нингидрина. (Раствор нингидрина готовят растворением 0,25 г в смеси 4 мл фосфорной кислоты (1:1) и 6 мл ледяной уксусной кислоты при 70ºС). Нагревают при 100ºС в течение 1 ч. После охлаждения разбавляют CH3COOH лед. В мерной колбе емкостью 10,0 мл, через 1 ч измеряют поглощение Ах при соответствующем λmax: лизин – 530 нм, оксилизин – 450 нм, орнитин и пролин – 515 нм, цистеин – 570 нм. Аналогичные процедуры производят с 1,0 мл стандартной аминокислоты.
Сравнивают оптические плотности Ах и Аст. Методика 3 Смешивают 1 мл раствора пробы с 0,5 мл буферного раствора рH=5,3 – 5,4 и 0.5 мл 3 % – ного раствора нингидрина в целлозольве. Нагревают 15 мин при 100ºС. Добавляют 5 мл 50 % – ного изопропанола, взбалтывают. Охлаждают до комнатной температуры, разбавляют в мерной колбе емкостью 10,0 мл тем же изопропанолом,
перемешивают, измеряют оптическую плотность при λmax согласно табл.1.1 Методика 4 Гидролизуют 1,0 г исследуемого белка кипячением с 1 мл 4М HCl в течение 15 ч ( с обратным холодильником), выпаривают досуха. Сухой остаток обрабатывают одновременно 4 мл 3 % – ного раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл 10 % – ного раствора фосфорномолибденовой кислоты для удаления пептонов, фильтруют.
Отбирают 0,5 мл фильтрата в стаканчик, добавляют 0,5 мл 2 % – ного водного раствора нингидрина, нагревают 10 мин при 100 ºС. После охлаждения разбавляют до 50 мл водой, переносят в делительную воронку с 10,0 мл изобутанола, встряхивают в течение 3 – х минут. Отделяют верхний слой, измеряют поглощение Ах при 533 нм. 0,5 мл стандартного раствора аминокислоты смешивают с 0,5 мл раствора нингидрина, нагревают и т.д.
Измеряют поглощение Аст при той же длине волны. Сравнивают оптические плотногсти Ах : Аст.[7] 4. Обзор реферативных журналов 08.03-19Р1.157. Применение экстракции в точке помутнения к казеиновым белкам коровьего молока и их идентификация при помощи масс-спектрометрии. Cloud point extraction applied to casein proteins of cow milk and their identification by mass spectrometry. Lopes Aline Soriano, Garcia Jerusa
Simone, Catharino Rodrigo Ramos, Santos Leonardo Silva, Eberlin Marcos Nogueira, Arruda Marco Aurelio Zezzi. Anal. chim. acta. 2007. 590, №2, с 166-172. Англ. Разработана улучшенная методика определения трех казеиновых белков в коровьем молоке. Методика включает выделение белков из пробы (50 мкл) путем экстракции в точке помутнения при рН 7,0
с использованием Тритона Х-114 и NaCl в качестве поверхностно-активного вещества и электролита соответственно и последующее детектирование белков методом времяпролетной масс-спектрометрии с ионизацией путем лазерной десорбөии из матрицы. 04.22-19Р1.19. Одновременное определение аминокислот в пищевых продуктах методом капиллярного электрофореза при косвенном детектировании в уф-лучах. Chen Bing, Li Xiaoge, He Ping, Xiang Xiaolan (Nanjing
University of Technology, Nanjing 210009, China) Sepu=Chin. J. Chromatogr. 2004 22, №1, с 74-76 Библ. о Кит, рез. англ Разработана методика определения L-орнитина, L- пролина и L-глютамина в пищевых продуктах. Разделение методом капилярного электрофореза в буферном растворе, содержащем 5 мМ/л натриевой соли р-аминобензолсульфоновой кислоты и 10 мМ/л
KH2PO4 (рН 11,5) с УФ-детектированием при 254 нм при напряжении 12 кВ. Полное разделение 3 аминокислот происходило за 11 мин. Среднеквадратическое отклонение для времени выхода составляло 0,72%, а для высоты пика 2,0% ПрО для определения L-орнитина, L-пролина и L-глютамина составлял 6,78, 8,71 и 7,86 мг/л, соответственно. Предложенный метод успешно использован для исследования различных пищевых продуктов со средним выходом 96,8-104%.
В. М. Гильзин 08.06-19Р1.162 Методы исследования молочных и молокосодержащих продуктов. Юрова Е.А. Молоч. дело. 2006, №8, с. 34-36. Рус. Применяемые в настоящее время в молочной промышленности методы анализа разделяют на используемые в научных целях и не всегда воспроизводимые в условиях заводской лаборатории и методов контроля применения для производственного контроля, которые не позволяют производить идентификацию продукции и тем самым качественно осуществлять входной контроль.
Методы анализа используют для изучения химического состава сырья, полуфабрикатов и готовой продукции, их физико-химических, биологических и технологических возможностей с целью выявления возможных фальсификаций и создания оптимальных технологических процессов для переработки сырья в целях получения готовой продукции высокого качества. В настоящее время для продуктов сложного сырьевого состава (растительно-молочных, молочно-растительных и т. д.) необходимо выделить методы пробоподготовки, т. е. методы, применяемые
для разделения и выделения отдельных компонентов, т. к. для проведения количественного определения нормируемых показателей без освобождения от влияющих компонентов невозможно. В основе экстракционного метода для определения массовой доли жира лежит методика, основанная на экстрагировании жира эфирами после обработки исследуемого образца раствором соляной кислоты. К. В. Беляев 09.08-19Г.162. Специфическое определение селеноаминокислот в цельном использованием эксклюзионной
ион-парной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии – масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой. (HPLC-ICP MS). Specific determination от selenoammoaads in whole milk by 2D size-exclusion-ion-paring reversed phase high-performance liquid chromatography — inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC — ICP MS). Bierla Katarzyna, Szpunar Joanna, Lobinski Ryszard. Anal. chim. acta.
2008. 624, Ns2, с 195-202. Англ. Методика разработана для определения селенометионина и селеноцистеина в цельном молоке. Она основана на удалении протеинов, карбамидометилировании остатков аминокислот с помощью иодацетамида и протеолизе с помощью Protease XIV. Селеноаминокислоты определяли методом HPLC-ICP MS после выделения из постколоночной смеси эксклюзионной жидкостной хроматографией.
В данных селеноаминокислотах Se(IV) хорошо дериватизируется и определяется совместно. Правильность проверена использованием изотопов . Все три компонента количественно определены методом стандартных добавок. Методика применена для мониторингаформ селена, в том числе при определении селенсодержащих дрожжей, добавленных при переработке молока. Список использованной литературы 1.Балаховский И.С. Определение суммарного количества аминокислот в молоке и других кисломолочных продуктах /
И.С. Балаховский, В.А. Варфоло-меев // Лаб. дело. – 1977. – № 4. – С. 213–216. 2.Цветкова Н.Д. Технология молока и молочных продуктов: Технология масла: курс лекций / Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. – Кемерово, 2005. – 80 с. 3.Отто М. Современные методы аналитической химии. – М.: Техносфера, 2004. Т. 2 4.Современные методы анализа и оборудование в санитарно-гигиенических исследованиях.
– М.: ФГУП «Интеосэн», 1999 5.Иванова М.А Белоглазкина М.В Богомолова И.В Федоренко Е.В. Аналитическая химия и физико-химические методы анализа. – М.: РИОР, 2006 6.Хроматография. Практическое приложение метода / под ред. Э.Хефтмана М.: Мир, 1986. Т. 1 и 2. 7.Гороховский В.И. Аналитическая химия. – М.: Колос С, 2000.