Новосибирский государственный аграрный университет
Агрономический институт
Факультет защиты растений
Кафедра биологической защиты
Курсовой проект по биотехнологии
«Проект биолаборатории и технологическая карта производства пириформина»
Выполнила:
студентка 532гр
Исаева М. В.
Проверила:
Шпатова Т.В.
Новосибирск 2010
Реферат.
Данный курсовой проект по биотехнологии в защите растений выполнен на 17страницах машинописного текста. Включает в себя 1 таблицу, 2 рисунка. Для написания проекта были использованы 6 источников литературы.
В работе были использованы следующие ключевые слова – биологическая защита растений, биопестицид, пириформин, технологическая карта, производств, сырье, материалы, приборы, стандартизация, контроль качества, технико-экономический расчет, конечный продукт, биологическая эффективность.
Оглавление стр
Введение………………………………………………………………………. 4
1. Аналитический обзор литературы…………………………………… 5
2. Технологическая карта производства пириформина………………. 7
2.1. Характеристика конечного продукта…………………………….. 7
2.2. Технологическая схема производства…………………………….. 8
2.3. Сырье и материалы…………………………………………………. 9
2.4. Оборудование и приборы…………………………………………… 9
2.5. Описание технологического процесса…………………………….. 9
2.6. Контроль качества продукта и стандартизация………………….. 11
2.7. Техника безопасности………………………………………………. 12
2.8. Технико-экономический расчет…………………………………….. 13
3. Проект биолаборатории…………………………………………………. 14
Заключение………………………………………………………………….. 16
Список литературы…………………………………………………………. 17
Введение
Хорошо известно, что здоровье человека находится в прямой зависимости от чистоты потребляемой продукции и окружающей среды. Поэтому с каждым годом вводятся все более жесткие ограничения на применение химических пестицидов, повышаются требования к качеству продукции овощеводства. Появилась необходимость широкого применения биологических средств защиты растений. Как известно, биологический метод базируется на использовании биопрепаратов и на выпуске полезных насекомых и клещей – хищников и паразитов.
Особо остро стоит вопрос о защите растений в закрытом грунте. Биологическая защита тепличных овощей от вредителей базируется в основном на микробиометоде. Широко применяется златогласка обыкновенная, муха-галлица, амблисейулюс, энкарзия, предпринимаются попытки расширить набор энтомофагов и паразитов.
Опыт показал однако, что ориентация только на макробиометод не всегда дает положительные результаты. При нарушениях, например, теплового режима в хозяйстве или вследствие влияния других биотических и абиотических факторов возникают срывы в разведении и применении насекомых.
Лучшие результаты дает совместное применение макро- и микробиологических средств борьбы с вредителями. В качестве микробиологических препаратов для закрытого грунта рекомендованы грибные агенты, производство которых налажено только в биолабораториях.
Одним из биологических препаратов на основе грибных агентов против вредителей закрытого грунта является пириформин. Он применяется против: оранжерейной белокрылки (TrialeurodesvapovariorumWestw), персиковой тли (MyruspersicaeS.), бахчевой тли (AphisgossypiiGlow), большой картофельной тли (MacrosiphumeuphorbiaTham), обыкновенной картофельной тли (AulacorahumsolaniKalt), капустной тли (BrevicorynebrassicaeL.) [1]
1. Аналитический обзор литературы
Быстрый рост населения земного шара вызывает необходимость дальнейшего увеличения производства продуктов питания. Интенсификация сельскохозяйственного производства с использованием традиционных методов (селекция пород животных и сортов растений, химизация, мелиорация) в большинстве случаев достигает своего предела. Кроме этого существующие сельскохозяйственные технологии не являются возобновляющими. В течение 20 лет мы потеряли 15% плодородного почвенного слоя, а используемые природные источники энергии также небезграничны. Наконец, большая часть пригодных к возделыванию почв уже вовлечена в сельскохозяйственное производство. Все это привело к возникновению ряда экономических и экологических проблем, связанных с загрязнением окружающей среды, истощением энергетических ресурсов, возрастанием затрат на единицу продукции. Стал необходимым поиск новых подходов, которые в дальнейшем позволили бы повысить урожай и улучшить качество основных сельскохозяйственных культур, но были бы экономичны в производстве и не наносили вреда окружающей среде. Одним из таких подходов является биотехнология.
Биотехнология на современном этапе пронизывает все сферы человеческой деятельности: медицину, промышленность, сельское хозяйство. Биотехнологические методы все более широко используются в защите растений от вредных организмов. Использование биотехнологии в защите растений открывает новые перспективы в создании новых устойчивых сортов и экологически безопасных средств защиты растений.
Биотехнология решает три основные проблемы защиты растений:
1. Получение генетически модифицированных сортов растений, устойчивых к вредным организмам (с использованием методов молекулярной генетики).
2. Создание биологических средств защиты растений (с использованием методов микробиологии, биохимии и технической энтомологии).
3. Разработка методов и средств диагностики объектов защиты растений (с использованием методов клеточной и молекулярной биологии).
Каждая из данных проблем важна и ее решение имеет большое значение для защиты растений. Но с каждым годом вводятся все более жесткие ограничения на применение химических пестицидов. Поэтому создание биологических средств защиты растений очень актуально. [5]
Биологический препарат для защиты от вредных организмов – это биологическое средство контроля с вредителями, возбудителями болезней растений и сорняками, активным ингредиентом которого являются агенты биологической природы. Так, основой биопрепаратов против вредителей являются возбудители болезней насекомых, клещей, нематод или грызунов, против болезней растений – антагонисты или гиперпаразиты возбудителей болезней, против сорняков – фитопатогенные высокоспецифические микроорганизмы. [3]
В данном курсовом проекте рассмотрено получение биопрепарата – пириформин. Этот энтомопатогенный препарат производится на основе гриба Entomophthorapyriformesпротив вредителей закрытого грунта. Состав основных и факультативных вредителей овощей закрытого грунта варьирует от зоны и набора культур. [1]
Вредители чувствительные к пириформину:
Оранжерейная белокрылка – повреждает томаты, сою, арбузы, дыню. Петрушку, иногда вредит огурцу. В Новосибирской области последнюю вспышку численности белокрылки наблюдали в 1983 году.
Персиковая тля – многоядный вредитель, питается на растениях томатов, перца, петрушки, салата, горчицы и даже злаковых. Вспышки высокой численности наблюдаются повсеместно. Особенно вредоносны в весеннее-летний период.
Бахчевая тля – особенно охотно заселяют растения огурцов, может питаться также на кабачках, баклажанах, дынях, арбузах.
Большая картофельная тля – повреждает томаты, огурцы. Это факультативный вредитель теплиц. Является также переносчиком вирусных заболеваний пасленовых.
Обыкновенная картофельная тля – питается на томатах, встречается на огурце, салате. Является факультативным вредителем тепличных растений.
Капустная тля – вредит рассаде капусты, горчице листовой, салату, редису, редьке майской. Из-за обильных сахаристых выделений заметно ухудшает товарный вид продукции.
Зараженные энтомофторозом особи тлей приобретают красновато-коричневый оттенок, теряют подвижность, не питаются. Через 7-10 дней с момента заражения гибнут и мумифицируются. Мумии прикреплены к субстрату ризоидами (выростами гриба с брюшной стороны тела насекомого). На теле прорастают конидиеносцы с конидиями, которые активно отстреливаются и образуют на субстрате вокруг тли мучнисто-белый ореол. Внутри тела тли одновременно с ростом конидиеносцев образуются покоящиеся споры.
Препарат эффективен в борьбе с активными стадиями сосущих насекомых, а также против нимф оранжерейной белокрылки. Не обладает овицидным действием, поэтому сроки повторных обработок определяются временем отрождения из яиц нового поколения вредителей. Длительность действия пириформина 10 суток (при отсутствий капельного полива и некорневых подкормок) [1].
Препарат не обладает фитотоксичностью и не вызывает ожогов растений. Не отмечено аллергических воздействий пириформина на человека. При массовых размножениях вредителя допустимо повторять истребительные мероприятия до 5 раз. На протяжении одной вегетации не вызывает привыкания вредителей к препарату. Также не наблюдалось существенного влияния пириформина на златоглазку обыкновенную, сирфид, галлицу при выпуске энтомофагов и паразитов на 2-3 сутки после обработки растений.
2. Технологическая карта производства пириформина.
2.1.
Характеристика конечного продукта.
Пириформин – биопрепарат на основе гриба Conidiobolusthromboides (= Entomophthorapyriformes). Разработан в жидкой и сухой формах. Основное действующее начало – конидии и покоящиеся споры гриба.
Штамм E. Pyriformes-78-2 выделен в 1978 году из гороховой тли. В природе является также патогенном картофельных, злаковых, бобовой, яблонной и других видов тлей.
Конидии имеют светло-коричневую окраску, грушевидную форму с сосочками. При поверхностном культивировании гриб образует колонии светлого цвета с морщинистой поверхностью правильной формой. На поверхности колонии образуется белый налет конидиального спороношения.
Глубинная культура гриба образует в основном мицелиальные ростки, которые на 5 – 7-е сутки распадаются и образуют покоящиеся споры. Присутствие конидий в жидкой среде невелико – не более 10% спор. Обязательное условие хорошего роста – активная аэрация. Освещенность не влияет на рост и спорообразование гриба. Оптимальная температура от 220
С до 280
С. [1]
2.2.Технологическая схема производства пириформина
Процесс производства пириформина включает в себя стадии:
· Коллекционно – поддерживающий пересев маточной культуры.
· Получение инокулюма
· Культивация
· Высушивание, фасовка, упаковка
· Стандартизация и контроль качества
2.3.Сырье и материалы
Для приготовления питательной среды – соевая мука, глюкоза. Для поддержания маточной культуры – сусло пивное неохмеленное, агар микробиологический, дисцилированная вода. Материалы для производства пириформина: пробирки, марля, вата, бумага фильтровальная; для культивации качалка кругового вращения, колбы 1-3 литра или стеклянные емкости [1,5]
2.4.Оборудование и приборы
1. Термошкаф
2. Бактерицидные лампы
3. Холодильник
4. Качалка возвратно-поступательного движения
5. Мельница
6. Автоклав
7. Спиртовка
8. Иглы микробиологические
9. Спиртовка
10. Чашки Петри, колбы конические различной емкости
2.5.Описание технологического процесса.
Коллекционно – поддерживающий пересев и маточная культура
.
Поддерживающие пересевы необходимы для содержания гриба в жизнеспособном состоянии. Культуру хранят в пробирках на косяках сусло-агара. [1:3]
Приготовление питательной среды суслоагар.
Пивное сусло разбавляют дистиллированной водой до концентрации сахара 5-7%. К разбавленному суслу прибавляют 1,5-2% агар-агара и, перемешивая, нагревают на медленном огне до его расплавления. Готовую среду фильтруют и разливают в пробирки.
Пробирки с суслом стерилизуют при 0,5 атм 30 минут, после застывания среды гриб пересевают иглой стерильно в пламени спиртовки. При этом иглой с загнутым концом, с помощью которой кусочек среды с культурой переносится в новую пробирку. Гриб растят 5 суток при температуре 26±
30
С, после чего пробирки закрывают полунепроницаемым материалом (целлофаном, калькой, фильтровальной бумагой), завязывают и хранят в холодильнике при 5…100
С до 6 месяцев.
Для работы следует применять культуру выращенную в чашках Петри. Для этого чашки Петри стерилизуют при 1 атм в течение часа, заполняют стерильной средой сусло-агара [1:3]. После застывания на поверхность среды, в центр чашки стерильно в пламени спиртовки иглой наносят кусочек культуры. Гриб растят пять суток при 26±30
С, культуру в чашках хранят в холодильнике до 2 месяцев. Для предотвращения высыхания среды чашки рекомендуется завернуть в плотную бумагу.
Получение инокулята.
Для инокулята пригодна среда, обедненная углеводами: 1%соевой муки, 2%глюкозы. Колбы объемом 0,5-1,0 литра стерилизуют при 1 атм в течение 0,5 часа, заполняют средой на 1/5 часть, закрывают ватно-марлевыми пробками и снова стерилизуют при 0,5 атм 30 минут. В стерильную среду, когда она остынет, вносят кусочек культуры из чашки Петри возле пламени спиртовки. Культуру растят на качалке (скорость 150-240 об/мин) при температуре 26±30
С. За это время в среде образуются мицелиальные клубки, которые затее распадаются на короткие гифальные тела. Готовый инокулят содержит до 105
гиф/мл среды.
Потребность инокулята для засева культуры – 5% от объема инокулируемой среды, стартовый титр при этом составляет от 103
до 5х103
гиф/мл.
Культивация
Культивация проводится в ферментере. При его отсутствии несложно изготовить заменитель из стеклянной бутыли объемом 10 литров и более. Для хорошей аэрации по размеру горловины емкости изготавливается резиновая пробка, с тремя отверстиями. Одно отверстие (Ø20-30мм) необходимое для инокуляции, два других Ø 10-15 мм – для подачи и отсоса или кислорода. Посевное отверстие закрывается резиновой пробкой, к воздуходувным подводятся гибкие шланги по диаметру. Воздух подается и отсасывается через микробиологические фильтры для предотвращения заноса посторонней микрофлоры.
Для культивирования готовится среда, состоящая из 1% соевой муки и 5% глюкозы. При использовании заменителей сои или глюкозы необходимо рН среды доводить до 7.
Выращивание в емкостях на качалке. Емкость стерилизуют при 1 атм в течение часа, заполняют средой на 1/5 часть объема, повторно стерилизуют при 0,5 атм 30 минут. В остывшую среду вносят инокулят в пламени горелки или в факеле. Культуру выращивают пять суток на качалке при 26±30
С.
К концу культивации в среде образуется до 106
покоящихся спор/мл, которые являются основным действующим началом препарата. [1]
Высушивание, фасовка, упаковка.
Субстрат со зрелой массой гриба высыпают в пластиковые или эмалированные кюветы слоем не более 3 см и проводят сушку при 30…350
С, хорошей вентиляции и периодическим перемешиванием. Влажность готового препарата не должна превышать 8%.
Готовый препарат затаривают в мешки из крафт-бумаги. Каждый мешок маркируют с указанием номера партии, вида субстрата, даты изготовления препарата, титра, срока и условий хранения. Так же необходимо приложить инструкцию по применению пириформина [5]
2.6. Контроль качества и стандартизация пириформина
Для определения количества жизнеспособных спор в готовом препарате используется два метода: прямой подсчет в камере Горяева и метод высева на твердую питательную среду в чашках Петри.
Определение титра в камере Горяева.
От каждой партии препарата отбирают 3-5 проб из разных мест по всей глубине и составляют общую пробу массой 70-100 г. Общую пробу тщательно перемешивают, после чего отвешивают навеску 10г с точностью 0,01г и переносят в колбу со 100 мл стерильной воды и стерильным крупнозернистым песком. Колбу закрывают стерильной пробкой и взбалтывают ее содержимое в течение 5 минут. Разведение препарата в приготовленной взвеси составляет 1:10 Параллельно готовят 7-9 пробирок, в каждую из которых добавляют по 9 мл дистиллированной воды, закрывают ватными пробками и стерилизуют. Затем готовят серию последовательных разведений. Для этого из колбы чистой пипеткой берут 1 мл суспензии и переносят в первую пробирку с 9 мл воды, получают разведение 1:100. Суспензию этого разведения тщательно перемешивают с помощью новой (чистой) пипетки, затем берут 1 мл полученного разведения и переносят его во 2 пробирку (разведение в 1000 раз). Для каждого нового разведения необходимо использовать отдельную стерильную пипетку
Камеру Горяева с хорошо притертым стеклом заполняют суспензией соответствующего разведения. Количество спор подсчитывают в 5 больших квадратах камеры (или в 20-100 малых квадратах), определяют среднее количество клеток в 1 малом квадрате и рассчитывают по формуле
Х=N×4×106
,
Где Х – титр исследуемой суспензии клеток/1 мл
N – среднее количество клеток в одном малом квадрате
Для определения титра исходного препарата необходимо титр исследуемой суспензии умножить на соответствующее разведение.
Определение титра методом посева на питательную среду
Готовят серию последовательных разведений как указанно в предыдущем методе. Из трех последних разведений, предварительно тщательно перемешанных, производят посев в чашки Петри на агаризованную среду Чапека или сусло-агар из расчета 1 мл суспензии на чашку. Этот объем распределяют по поверхности среды шпателем. Из одного разведения делают не менее 5 параллельных высевов. Для параллельных высевов из одного разведения можно пользоваться одной стерильной пипеткой и одним шпателем. Засеянные чашки помещают в термостат с температурой 23-250
С. Первый учет роста гриба проводят через 4-5 дней после посева, а затем через каждые 2-3 дня отмечают вновь появившиеся колонии антагониста. Титр препарата вычисляют по формуле:
Т=А+К
Где Т – титр препарата, спор/1г
А – среднее число колоний, выросших при высеве из данного разведения (среднее арифметическое из 5 чаш Петри)
К – разведение, из которого произведен высев.
При использовании чашечного метода все операции необходимо проводить в стерильном боксе [5].
2.7. Техника безопасности
При производстве пириформина следует соблюдать общие правила безопасности в микробиологических лабораториях
· При изготовлении суспензий необходимо пользоваться пипеткой с резиновой грушей
· При взятии навески или проб работу необходимо проводить в вытяжном шкафу
· Не допускать попадание живой культуры на кожу рук
· После окончания работы вымыть руки теплой водой с мылом
Кроме этого к работе допускаются лица прошедшие предварительный медицинский осмотр, инструктаж по технике безопасности и получившие письменное разрешение на право работы с биологическими агентами. Персонал должен быть обеспечен и систематически пользоваться спецодеждой:респиратором типа РУ-60 МА или ШБ-1 «лепесток», резиновыми перчатками, резиновым фартуком.
Во время обработок запрещено пить, курить, принимать пищу. [1,4,5]
2.8. Технико-экономический расчет
Таблица 1
Перечень оборудования и материалов для получения пириформина
Наименование
Количество, шт
Для производства пириформина
Пробирки
Не менее 50
Вата и марля (для приготовления пробок)
–
Спиртовка
1
Иглы микробиологические
–
Чашки Петри
Не менее 50
Колбы конические 0,5-1 л
Не менее 50
Термошкаф (для культивирования и сушки препарата)
2
Бактерицидные лампы (для стерилизации помещения)
2
Холодильник для хранения культур
1
Качалка возвратно-поступательного движения (для роста инокулята)
1
Фильтрующий материал (полотно или бумажные фильтры)
–
Мельница
1
Автоклав
1
Для культивации
Качалка кругового вращения
1
Колбы 1-3 л или стеклянные емкости
Исходя из разрешающей способности качалки
Нормы расхода ректификованного для стерилизации бокса и оборудования.
1. Обработка рук и инструментов – 10мл на 1 раз
2. Горение спиртовки 1ч – 130мл
3. Разовая обработка бокса и емкости – 50м
3. Проект биолаборатории
Для производства пириформина необходима биолаборатория. Производственная биолаборатория – специфическое и сложное хозяйство, в составе которого имеются здания или помещения, различное оборудование.
1. Рабочая комната – холодильник для хранения культур
2. Автоклавная – в данном помещении располагается автоклав для стерилизации среды.
3.4. Бокс с предбоксником – качалка кругового вращения.
5. Термостатная. Термостат для культивации гриба.
6. Комната для сушки биомассы – в данной комнате расположен термошкаф.
7. Моечная – мойка со столом.
8. Комната для размола биомассы – мельница для размола.
9. Комната для контроля качества.
10. Склад для хранения препарата.
Заключение
Биологические препараты играют ключевую роль в биологической защите от вредителей, болезней. Их использование относится и к оперативным и к фундаментальным способам воздействия на вредные организмы в агроэкосистемах. Как правило, применение биопрепаратов запускает механизмы экологически безопасной защиты растений. Воздействуя только на целевые мишени, биопрепараты обеспечивают активное участие других естественных регуляторов численности в подавлении фитофагов, фитопатогенов или сорных растений. Поэтому актуальной становится тема разработки новых биологических препаратов [5].
В данном курсовом проекте был разработан проект биолаборатории и технологическая карта производства биологического инсектицида – пириформина. Был произведен аналитический обзор литературы по данной теме, описана технологическая схема производства пириформина, был произведен технико-экономический расчет, а также были приведены сырье, материалы, оборудование и приборы для производства биопрепарата.
Список литературы
1. Производство и применение пириформина в защите овощей закрытого грунта от вредителей: Рекомендации/ВАСХНИЛ Сиб. отд-ние
НПО «Земледелие» – Новосибирск, 1989.-24с
2. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации 2009 г. Справочное издание, 320с.
3. Штерншис М.В., Джамилов Ф.С., Андреева И.В., Томилова О.Г./Биопрепараты в защите растений: Учебное пособие/Мин-во сельского хозяйства Р.Ф. Новосиб. Гос. Агроуниверситет – Новосибирск, 2000. – 128с.
4. Штерншис М.В. биотехнология в защите растений: учебное пособие/ Мин-во сельского хозяйства Р.Ф. Новосиб. Гос. Агроуниверситет – Новосибирск, 2001. – 156с.
5. Штерншис М.В. биотехнология в защите растений: учебное пособие/- 2-е изд., перераб и доп./Новосиб. Гос. Агроуниверситет – Новосибирск, 2006. – 2000с.
6. Штерншис М.В. регуляция численности вредителей с/х культур с помощью энтомопатогенов: Лекция/ Новосиб. Гос. Аграр. Ун-т. – Новосибирск, 1991г. – 60с.
7. Сельскохозяйственная энтомология/А.А. Мигулин, Г.Е. Осмоловский, Б.М. Лтвинов и др.; Под ред. А.А. Мигулина. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Колос, 1983 – 416с., ил. – (Учебники и учебные пособия для высш. с-х. учеб. заведений)
8. Монастырский О.А. Биологизация защиты растений: отставание России становится все более очевидным//Защита и карантин растений, №11, 2004г – с.20-21