«Розробка технологій генетичного поліпшення якості кукурудзяного крохмалю для створення джерел імпортозамінної сировини»

рефератциклу наукових праць «Розробка технологій генетичного поліпшення якості кукурудзяного крохмалю для створення джерел імпортозамінної сировини», який висунуто на здобуття премії Президента України для молодих вчених в галузі науки і техніки в 2011 р.Метою роботи була розробка технологій генетичного поліпшення якості кукурудзяного крохмалю і створення на цій основі імпортозамінних джерел стратегічно важливої для країни сировини – крохмалів амілозного та амілопектинового типів, яких гостро потребують харчова, фармацевтична та технічні галузі промисловості України. Створення джерел високоякісних кукурудзяних крохмалів на Україні до останнього часу не здійснювалося, тому дана розробка відрізняється принциповою новизною і національних аналогів не має. В якості основного методу вирішення проблеми було використано біохімічний ефект природних моногенних мутацій структури ендосперму кукурудзи. Такий підхід має суттєві переваги перед іншими шляхами генетичного поліпшення якості крохмалю. Більшість мутантних генів структури ендосперму викликає суттєве поліпшення якості зерна кукурудзи. Ендоспермальні мутації мають природне походження і їх включення до генотипів кукурудзи на відміну від трансгенних технологій забезпечує повну генетичну безпечність товарної продукції. Всі мутантні гени структури ендосперму мають сталі візуально диагностовані фенотипові маркери алельного стану, незалежні від агро- кліматичних умов вирощування. Мутантні гени структури ендосперму успадковуються як менделюючі фактори і це створює сприятливі умови для прогнозування частот вищеплення корисних генотипів. Нарешті, застосування для поліпшення якості крохмалю виключно ефектів полігенних комплексів виявилося малорезультативним. Дослідження по проблемі здійснювалися протягом 2001-2008 років в рамках виконання завдань Державних науково- технічних програм “Теоретичні основи селекції сільськогосподарських культур”, “Генетичні ресурси рослин”, ” Генетичні системи комплексних ознак адаптивності сільськогосподарських культур” та “БІОСИРОВИНА. Створити щорічно поновлювані джерела біосировини рослинного походження і розробити технології їх багатоцільового промислового використання. В ході проведених досліджень проаналізовано біохімічний ефект 12 мутантних генів структури ендосперму кукурудзи і встановлено його індивідуальну специфічність. Визначено, що найкращими генетичними джерелами крохмалів амілопектинового типу є носії мутації wx, а високоамілозних крохмалів- носії мутацій su2 та ae. Встановлено, що мутантний ген wx викликає утворення крохмалів, що майже повністю складаються з амілопектину, причому цей ефект має фіксований характер, незалежний від генотипу рекурентної батьківської форми та погодних умов вирощування і успадковується як практично якісна ознака. Визначено, що мутація wx не викликає суттєвого зниження зернової продуктивності та погіршення інших ознак якості зерна. Мутантні гени su2 та ае підвищували частку амілози в крохмалі відповідно до 45,9 % та 63,5 % і перевищували в цьому відношенні звичайну кукурудзу відповідно в 1,5- 2 та 2-2,5 рази. Однак ефект цих мутацій був нефіксованим і залежав від погодних умов вирощування та генотипу рекурентної батьківської форми. Мутації su2 та ае викликали зниження зернової продуктивності ліній ( на 2,8 – 26,8 г зерна з рослини) і вмісту крохмалю в зерні ( на 7,8 – 12,9 %) та підвищення вмісту білку ( на 0,3 – 2,9 %), лізину в білку ( на 0,5- 1,1 %) та триптофану в білку ( на 0,1- 0,2 %). Встановлено, що генетично обумовлений рівень господарсько цінних ознак у ліній – носіїв крохмаль- модифікуючих мутацій та норми їх реакцій на погодні умови вирощування проявляються як незалежні властивості генотипу. Це створює можливості ідентифікації ліній з високими та стабільними по роках рівнями господарсько цінних ознак. В проведених дослідах було ідентифіковано мутантні лінії, які відрізнялися стабільно високою продуктивністю, вмістом крохмалю в зерні і амілози в крохмалі навіть в контрастних погодних умовах вирощування. В ході досліджень було встановлено можливості поєднання в межах одного генотипу високого вмісту і бажаного фракційного складу крохмалю та результативність підсилення біохімічного ефекту крохмаль- модифікуючих мутантних генів за рахунок їх взаємодії з полігенними комплексами. Отримані результати показали, що перерозподіл фракційного складу крохмалю суттєво позначається на розмірах та морфолого- анатомічних властивостях крохмальних гранул ендосперму. За фракційним складом гранул носії мутації wx наближалися до звичайної кукурудзи, тоді як носії високоамілозних мутацій відрізнялися різко збільшеною часткою гранул дрібних розмірів. У звичайної кукурудзи крохмальні гранули мали незначну шпаруватість, локалізовану в центрі гранули, у носіїв мутації wx гранули були майже полишені шпарин, носії мутації su2 відрізнялися чіткою вираженою радіальною шпаруватістю гранул, а крохмальні гранули мутанту ае були дуже дрібними і схильними до утворення конгломератів. В ході виконання дослідів було проаналізовано експресивність крохмаль- модифікуючих мутантних генів протягом розвитку насіння. Встановлено, що вміст крохмалю у звичайної кукурудзи і носіїв мутантних генів wx, su2 та ае в процесі достигання насіння постійно зростає, але цей процес має нелінійний характер – основний приріст крохмалю у ліній всіх зазначених чотирьох типів відбувається до 40 дня після запилення. У звичайної кукурудзи та носіїв високоамілозних мутацій протягом розвитку насіння вміст амілози в крохмалі теж зростав до 40 дня після запилення, а потім цей процес значно уповільнювався. Однак на всіх фазах розвитку високоамілозні лінії за вмістом амілози в зерні значно перевищували звичайну кукурудзу. Навпаки, лінії- носії мутації wx протягом всього періоду достигання характеризувалися практично повною відсутністю амілози в крохмалі. Таким чином, в дослідах було зареєстровано ефект диференціальної експресії крохмаль- модифікуючих мутацій за вмістом та фракційним складом крохмалю і принципові відмінності різних генів структури ендосперму в регуляції процесу утворення сополімерів крохмалю. Встановлено, що неспоріднені за походженням лінії з тотожним алельним станом крохмаль- модифікуючих генів структури ендосперму суттєво відмінні між собою за ефектами комбінаційної здатності щодо продуктивності та основних ознак якості зерна. В ході виконання дослідів було ідентифіковано мутантні лінії з високими і стабільними по роках ефектами комбінаційної здатності за основними господарсько цінними ознаками, а також лінії, що поєднували високі ефекти загальної та специфічної комбінаційної здатності. Визначено, що успадкування продуктивності та вмісту крохмалю в зерні гібридами восковидної та високоамілозної кукурудзи здійснюється за типом позитивного наддомінування, білка в зерні – за типом негативного наддомінування, або неповного домінування з переважним внеском в дисперсію ефектів домінування, олії в зерні – за тим же типом, але з переважним внеском в дисперсію адитивних ефектів. Вміст амілози в крохмалі гібридів восковидної кукурудзи практично не відрізнявся від батьківських ліній, а у гібридів високоамілозної кукурудзи він успадковувався за типом негативного наддомінування або неповного домінування з переважним внеском в дисперсію адитивних ефектів. Отримані в дослідах результати свідчать, що вміст амілози в крохмалі ліній та гібридів на основі високоамілозних мутацій, вірогідніше всього, є узагальненим наслідком взаємодії мутантних генів su2 та ae з ефектами полігенних комплексів, хоча варіації за вмістом амілози можуть бути викликані і множинним алелізмом в цих локусах. Встановлено, що системи генетичної регуляції вмісту білка та олії в зерні у восковидної кукурудзи, а також вмісту білка в зерні та амілози в крохмалі високоамілозної кукурудзи наближаються до адитивно-домінантної моделі Хеймана. Встановлено фізіологічні реакції рослинного організму на введення до його геному крохмаль- модифікуючих мутацій на гетеротрофній стадії індивідуального розвитку. Показано функціональну залежність між інтенсивністю проростання насіння та його масою та вмістом в ньому крохмалю. Обгрунтовано, що саме депресія утворення крохмалю є найбільш вірогідною причиною зниження посівних кондицій насіння крохмаль- модифікуючих мутантів кукурудзи. В ході виконання досліджень було також визначено активності та ізоферментний склад амілаз в ендоспермі проростаючого насіння ліній кукурудзи з крохмалями амілозного та амілопектинового типів, проаналізовано закономірності взаємодій субстрат-фермент в процесі ендогенного гідролізу крохмалю і особливості утілізації крохмалів з різним фракційним складом протягом проростання насіння. Розроблено оригінальну методику отримання ендоспермальних рекомбінантів кукурудзи з використанням експериментально зареєстрованого в дослідах ефекту епістатичних взаємодій між генами структури ендосперму за фенотипом насіння. За допомогою цієї методики отримано понад 150 носіїв рекомбінацій між генами структури ендосперму і визначено ефекти неалельних взаємодій між ними. Аналіз ендоспермальних рекомбінантів дозволив встановити наявність двох ефектів, що виникають при неалельних взаємодіях мутантних генів структури ендосперму. По-перше, це епістатичні ефекти, внаслідок яких мутантні гени, які викликають більшу депресію утворення крохмалю подавляють активність генів, які викликають меншу депресію утворення крохмалю. За вмістом білку в зерні такі ефекти зафіксовано, зокрема, у рекомбінації o2sh2, за вмістом олії в зерні- у рекомбінацій o2su1 та o2sh2, а за вмістом крохмалю – у рекомбінацій o2sh1,o2sh2 o2su1 та o2ae. За фракційним складом крохмалю мутантний ген wx був епістатичний до інших мутантних генів структури ендосперму за виключенням лише мутантного гену ае. Другим наслідком неалельних взаємодій між генами структури ендосперму було синергічне підвищення або зниження вмісту білку, незамінних амінокислот, олії та крохмалю. Позитивний синергічний ефект за вмістом білку, зокрема, спостерігався у рекомбінацій мутантного гену о2 з мутантними генами sh2 та su1, а негативний – у рекомбінації o2wx. Синергічне підвищення вмісту олії в зерні зареєстроване у рекомбінації о2su1, а синергічне зниження- у рекомбінацій о2wx та o2ae. Позитивний синергічний ефект за вмістом крохмалю проявили рекомбінації о2о1, o2fl1 та o2wx, а негативний – o2sh2. У носіїв рекомбінацій o2wx та o2sh2 в дослідах зареєстровано позитивний синергічний ефект за вмістом лізину та триптофану в білку, а у носіїв рекомбінації su2ae- за вмістом амілози в крохмалі. Експериментальні результати показали, що з суто практичного погляду на найбільшу увагу заслуговують рекомбінанти о2wx, o2su2 та o2ae, оскільки вони дозволяють поєднувати в межах одного генотипу високу якість крохмалю та білку і спрощують процедуру промислового виділення крохмалю із зерна кукурудзи. Результати проведених дослідів свідчать, що ефекти неалельних взаємодій між генами структури ендосперму за вмістом білку, олії та крохмалю в зерні дуже залежать від генотипів батьківських форм-партнерів рекомбінацій. У тотожних рекомбінацій ці ознаки відчували суттєву мінливість і її найбільш вірогідним чинником можуть бути визнані взаємодії мутантних генів структури ендосперму не тільки між собою, але й з полігенними комплексами. Набула подальшого розвитку технологія створення нового вихідного матеріалу для селекції гібридів з генетично поліпшеною якістю крохмалю. Обґрунтовано і експериментально підтверджено результативність використання для цієї мети гібридизації джерел крохмаль- модифікуючих мутантних генів з неспорідненими за походженням лініями звичайного типу з наступним інцухтом та індивідуальним добором кращих мутантних сімей. Експериментально встановлено паралелізм мінливості крохмаленосних культурних рослин за фракційним складом крохмалю і гомологію систем його генетичної регуляції. Внаслідок проведених дослідів сформовано новий національний тип кукурудзи- кукурудзу технічного призначення і створено понад 100 принципово нових ліній кукурудзи на основі крохмаль- модифікуючих мутацій. Генетичну колекцію ендоспермальних мутантів та рекомбінантів кукурудзи передано до Національного центру генетичних ресурсів України, а кращі мутантні та рекомбінантні лінії лінії включено в селекційну програму Інституту рослинництва ім.В.Я.Юр’єва НААН і впроваджено в інших селекційно- генетичних установах Української академії аграрних наук рослинницького профілю. Виділено серію гібридів з крохмалями амілозного та амілопектинового типів, які відрізняються підвищеною продуктивністю та стійкістю до несприятливих умов вирощування, хвороб та шкідників. Кращі із створених гібридів з крохмалями амілозного типу мають урожайність 50-55 ц зерна з гектара, вміст крохмалю в зерні 62-65%, вміст амілози в крохмалі 45-55%, вміст білку в зерні 12-13% і вміст олії в зерні 5,0- 5,5%. Кращі гібриди з крохмалями амілопектинового типу мають урожайність 60-65 ц зерна з гектара, вміст крохмалю в зерні 68-70%, вміст амілози в крохмалі менше 1%, вміст білку в зерні 11-12% і вміст олії в зерні 5,5-6,0%. В ході виконання розробки створено також гібриди з крохмалями амілозного та амілопектинового типу, які відрізняються високою біологічною цінністю білку ( вміст лізину в білку до 5,2% і триптофану в білку до 0,8% ) та високою якістю олії ( вміст гліцеридів лінолевої кислоти в олії до 65% ). Гібриди такого типу за сукупністю ознак якості продукції не поступаються кращим закордонним аналогам, пристосовані до безвідходної промислової переробки крохмаленосної біосировини і дозволяють поряд з високоякісними крохмалями в межах одного технологічного циклу отримувати цінні супутні продукти переробки. Кращі з цих гібридів проходять конкурсне та екологічне випробування. Створений за участі авторів розробки перший національний гібрид восковидної кукурудзи Сталкер внесено до Державного реєстру сортів України, а перший національний гібрид високоамілозної кукурудзи Талісман передано до Державного сортовипробування. Спільно з Харківським державним університетом харчування і торгівлі розроблено технології промислового використання гібридів кукурудзи з генетично поліпшеною якістю крохмалю для отримання нових видів харчових продуктів та біоутілізованих термопластичних матеріалів.Результати досліджень проведеної розробки узагальнено у 59 наукових публікаціях та 8 патентах на способи створення та промислового використання кукурудзи з крохмалями амілозного та амілопектинового типів. Результати розробки оприлюднено на ряді наукових нарад національного та міжнародного рівней. На основі цих результатів розроблено проекти Національних стандартів України по сертифікації селекційного матеріалу на основі крохмаль- модифікуючих мутацій кукурудзи і підготовано до офіційного патентування 6 патентоспроможних технічних рішень. Претенденти на здобуття премії:________________________ Діденко С.Ю.________________________ Ніколенко І.А.________________________ Тимчук Д.С.