«Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

На правах рукописиШилько Татьяна АлександровнаПатогенетические факторы модуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови при туберкулезе легких14.00.16 – патологическая физиология03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биологияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наукТомск – 2009 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»Научные консультанты:доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, академик РАМН Новицкий Вячеслав Викторовичдоктор медицинских наук, профессор Уразова Ольга ИвановнаОфициальные оппоненты:доктор медицинских наук, профессор Агафонов Владимир Ивановичдоктор медицинских наук Потапов Алексей Валерьевичдоктор медицинских наук, профессор Салмина Алла БорисовнаВедущая организация: Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощиЗащита состоится «____»________________2009 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМНАвтореферат разослан «_____»_____________2009 г.Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Амосова Е.Н.^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность проблемы. Туберкулез остается серьезной и актуальной медицинской, социальной и экономической проблемой [Краснов В.А., 2008; Jeong Y.J., Lee K.S., 2008]. Изучение эпидемиологической ситуации за последние годы показало, что прогноз относительно ликвидации туберкулеза не оправдался. Данные Европейского регионального бюро ВОЗ свидетельствуют о том, что распространение туберкулеза приобрело угрожающие масштабы. Так, например, в России заболеваемость туберкулезом в 2007 г. достигала 83,2 случаев на 100 тыс. населения, а в Томской области в 2007 г. – 102,5, в 2008 г. – 101,4. Серьезную эпидемиологическую проблему представляют группы риска – лица с асоциальным поведением, иммигранты, наркоманы, дезадаптированные подростки, среди которых имеют широкое распространение лекарственно-устойчивые формы туберкулеза, включая полирезистентные варианты инфекции. Прогрессирующее увеличение числа случаев заражения антибиотико-рефрактерными штаммами микобактерий, устойчивых к двум, трем и более туберкулостатическим препаратам, является отрицательной тенденцией последних лет. Об этом свидетельствует рост частоты развития остропрогрессирующих форм лекарственно-резистентного туберкулеза с тяжелым клиническим течением и значительной распространенностью патологического процесса [Каминская Г. О. и соавт., 2006; Исакова Ж.Т. и соавт., 2007; Маркелов Ю.М., Дородная И.А., 2007; Фирсова В.А. и соавт., 2007] . Согласно современным представлениям, наиболее тяжелое течение туберкулеза отмечается при нарушении адекватного клеточного иммунного ответа [Масленников А.А. и соавт., 2007]. Ведущая роль в обеспечении противотуберкулезной защиты организма, как известно, принадлежит тканевым и циркулирующим фагоцитам – альвеолярным макрофагам, моноцитам и полиморфно-ядерным нейтрофилам, а также индукторам иммунного воспаления – лимфоцитам. Между тем, наиболее характерными признаками дизрегуляции иммунных процессов при туберкулезе, по данным ряда авторов, являются, прежде всего, нарушения структурно-метаболического и функционального статуса лимфоцитов и моноцитов [Комогорова С.Э. и соавт., 2005; Пичугин А.В., 2005; Фирсова В.А. и соавт., 2007]. Установлено, что патогенез иммунной гипо- и анергии при инфекционном процессе во многом обусловливается индуцированной возбудителем дезорганизацией хромосомного аппарата иммунокомпетентных клеток и систем, обеспечивающих генетический гомеостаз макроорганизма. Основную функцию гомеостатической регуляции в организме выполняют система ДНК-репарации, обеспечивающая внутриклеточное восстановление генетических структур, и апоптоз, обусловливающий поддержание баланса между делением и гибелью клеток и элиминацию аберрантных клеточных форм и инфицированных клеток. В то же время показано, что цитогенетические повреждения и дисфункция ДНК-репаративной системы могут служить своего рода индукторами апоптоза [Суханова Г.А., Акбашева О.Е., 2006; Camenisch U., Naegeli H., 2009]. Выяснение путей запуска и молекулярных механизмов дизрегуляции запрограммированной гибели отдельных клеток в многоклеточном организме является одной из нерешенных задач медико-биологических наук. Актуальность этой проблемы определяется тем, что срыв (угнетение или, наоборот, усиление) апоптозной программы в организме обусловливает развитие и прогрессирование ряда заболеваний, в том числе инфекционных. Так, например, установлено, что дефект Fas-индуцированного апоптоза моноцитов/макрофагов и стимуляция экспрессии на макрофагальных клетках антиапоптозного гена bcl-2 при туберкулезе являются ключевыми факторами латентной микобактериальной инфекции [Hirsch C.S. et al., 2005; Mustafa T., 2007, 2008]. Вместе с тем, многие вопросы относительно дизрегуляторных нарушений естественной гибели клеток и участия апоптоза в патогенезе иммунной дестабилизации при туберкулезном процессе остаются открытыми. До сих пор нет патогенетического обоснования роли перекисного окисления липидов, антиоксидантной защиты и ионного дисбаланса в реализации апоптозных потенций иммуноцитов и формировании бактериальной иммунорезистентности при туберкулезе.В свете изложенного представляется важным изучение молекулярно-биологических механизмов, определяющих развитие и характер течения туберкулезного процесса. Это, несомненно, расширит имеющиеся фундаментальные представления о патогенезе туберкулезной инфекции и, возможно, послужит основой для создания более совершенных методов диагностики и прогнозирования туберкулеза, выявления групп риска по развитию тяжелых прогрессирующих форм заболевания, а также для разработки более эффективных методов профилактики и коррекции иммунопатологических изменений, сопровождающих туберкулез и противотуберкулезные мероприятия.^ Цель исследования: выявить общие закономерности и факторы модуляции апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови при лекарственно-чувствительном и лекарственно-резистентном туберкулезе легких до и в условиях противотуберкулезной химиотерапии.^ Задачи исследования: Оценить уровень апоптоза мононуклеаров периферической крови у больных 18-55 лет с распространенным деструктивным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом легких (инфильтративным, диссеминированным, фиброзно-кавернозным туберкулезом легких и казеозной пневмонией). Оценить роль нарушений макро- и микроэлементного состава, цитогенетического статуса, структурных свойств мембраны, перекисного окисления липидов в индукции апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови при туберкулезе легких. Провести сравнительную оценку апоптоз-модулирующих факторов мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных легочным туберкулезом (лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым инфильтративным, диссеминированным, фиброзно-кавернозным туберкулезом легких и казеозной пневмонией) и у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких. Установить патогенетические факторы индукции апоптоза мононуклеаров периферической крови при отдельных клинических формах лекарственно-чувствительного и лекарственно-устойчивого туберкулеза легких до и в процессе противотуберкулезной полихимиотерапии.^ Научная новизна. Проведена комплексная оценка апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови у больных с различными клиническими формами (инфильтративный, диссеминированный, фиброзно-кавернозный, казеозная пневмония) распространенного деструктивного туберкулеза легких в связи с чувствительностью возбудителя к терапии до начала лечения и на фоне проведения противотуберкулезной химиотерапии. Установлено, что течение распространенного деструктивного лекарственно-чувствительного и лекарственно-устойчивого туберкулеза легких сопровождается активацией спонтанного и Н2О2-индуцированного апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови, уровень которого после курса интенсивной противотуберкулезной терапии становится еще выше, а после курса поддерживающей химиотерапии проявляет тенденцию к нормализации. При этом уровень апоптоза мононуклеарных лейкоцитов наиболее значителен при инфильтративной и фиброзно-кавернозной формах лекарственно-чувствительного (в лимфоцитах) и лекарственно-резистентного (в моноцитах) туберкулеза легких, в то время как при казеозной пневмонии имеет наименее выраженный характер. Охарактеризована роль нарушений цитогенетического статуса, структурной организации мембраны и макро- и микроэлементного состава (Ca2+, Na+, Fe2+, Mg2+, Al3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+) клеток и плазмы в модуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови при туберкулезе легких до и на фоне противотуберкулезной терапии. Установлены дифференциальные факторы индукции апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови. Наиболее значимыми из них при лекарственно-чувствительном туберкулезе легких оказались увеличение числа предуготовленных к апоптозу СD95+-клеток, хромосомные аберрации на фоне подавления ДНК-репарации (как фактор апоптоза лимфоцитов), повышение текучести мембраны и изменения макро- и микроэлементного состава клеток и плазмы (как фактор апоптоза моноцитов); при лекарственно-резистентном туберкулезе легких – нарушения липидного спектра мембраны и катионного состава внутриклеточной среды и плазмы. По результатам исследования сделано предположение о том, что апоптоз мононуклеарных лейкоцитов крови может быть реализован по Fas-опосредованному, а также (в связи с накоплением в клетках кальция) митохондриальному и церамид-опосредованому механизмам. Показано, что спектр факторов активации апоптоза при туберкулезе легких существенно отличается от такового при хронической обструктивной болезни легких; при этом перекисное окисление липидов опосредует повышенный уровень апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при лекарственно-чувствительном туберкулезе легких и не оказывает апоптогенный эффект при множественной лекарственной резистентности. Установлено, что на фоне специфической противотуберкулезной терапии спектр апоптоз-стимулирующих факторов варьирует, выраженность составляющих его изменений (равно как и непосредственно уровень активации апоптоза) возрастает после интенсивного курса лечения, в то время как после завершения фазы поддерживающей терапии уровень гибели клеток проявляет тенденцию к нормализации.^ Практическое и теоретическое значение работы. Полученные данные расширяют существующие фундаментальные знания о роли апоптоза в иммунопатогенезе туберкулезной инфекции, факторах активации программированной гибели лимфоцитов и моноцитов периферической крови у больных туберкулезом легких. Результаты исследования могут служить основой новых методологических подходов к иммунокоррекции, направленной на повышение жизнеспособности и регуляцию численности клеток крови, формирующих реакции доиммунного воспаления (моноциты) и адаптивного противотуберкулезного иммунитета (лимфоциты), а также быть использованы в качестве информативных критериев для оценки прогнозирования течения и исхода заболевания. Это позволит проводить своевременную профилактику осложнений легочного туберкулеза, в том числе вызванных иммунотоксическим действием применяемых в терапии туберкулеза фармакологических средств.^ Положения, выносимые на защиту: Течение туберкулеза легких сопровождается активацией апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови. Степень выраженности и спектр факторов индукции программированной гибели клеток зависят от клинической формы заболевания. При этом они наиболее значительны при инфильтративной и фиброзно-кавернозной формах лекарственно-чувствительного и лекарственно-резистентного туберкулеза легких, в то время как при казеозной пневмонии являются минимальными. К общим факторам индукции апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови при туберкулезе легких относятся повышенное содержание холестерина и фасфатидилинозитола в клеточной мембране в сочетании с уменьшением микровязкости ее липидного бислоя, а также увеличение внутриклеточной концентрации Ca2+, Al3+ и (при снижении содержания в плазме) Mg2+, Cu2+. При этом степень активности апоптоза моноцитарных клеток в связи со стимуляцией эксцизионной ДНК-репарации ниже, чем уровень программированной гибели лимфоцитов. При лекарственно-чувствительном туберкулезе, наряду с активацией перекисного окисления липидов, в структуре апоптогенных факторов лимфоцитов превалируют гиперэкспрессия CD95/Fas на фоне повышения количества хромосомных аберраций и подавления ДНК-репарации в клетках, а в числе факторов апоптоза моноцитов – повышение текучести мембраны и изменения внутриклеточной и плазменной концентрации макро- (Na+, Mg2+) и микроэлементов (Al3+, Cu2+). При лекарственно-резистентном туберкулезе апоптоз лимфоцитов и моноцитов индуцируют нарушения липидного спектра мембраны (увеличение концентрации холестерина и легкоокисляемых фракций липидов) и катионного (Fe2+, Na+, Mg2+, Cu2+) состава клеток и плазмы крови. К факторам модуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови, отличающим специфическую (туберкулез) и неспецифическую (хроническая обструктивная болезнь) патологию легких, относятся сопровождающие течение туберкулезного воспаления хромосомные аберрации (обмены, разрывы), изменения активности ДНК-репарации (подавление в лимфоцитах и стимуляция в моноцитах), катионного состава и повышение содержания холестерина в мембране клеток. В условиях интенсивной противотуберкулезной терапии усиление апоптоза мононуклеарных лейкоцитов обусловлено более выраженными (чем до лечения) перестройками их клеточной мембраны, повышением активности перекисного окисления липидов, а также (в направлении гибели лимфоцитов) числа хромосомных аберраций и концентрации макро- и микроэлементов (Fe2+, Al3+, Cu2+, Mg2+ в клетках и Ca2+, Na+ в клетках и плазме). При этом после курса поддерживающей химиотерапии восстановление активности процессов липопероксидации и ДНК-репарации, структуры и катионного состава клеток и плазмы определяет тенденцию к нормализации апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови.^ Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию противотуберкулезной службы Томской области, 75-летию кафедры фтизиатрии и пульмонологии СибГМУ «Проблемы туберкулеза и современные пути их решения» (Томск, 2004), Третьем Российском конгрессе по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004), Международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере» (Сургут, 2004), Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2005), VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005), Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2005), IV Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине (Тула, 2005), VII конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2006), XIII Российском научном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), Второй международной Германо-Российской конференции Форума им. Коха и Мечникова «Туберкулез, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении» (Томск, 2007), Internationaler Kongress Fachmesse: moderne aspekte der prophylaxe, behandlung und rehabilitation (Ганновер, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009), научных семинарах кафедр патофизиологии, фтизиатрии и пульмонологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2003-2009). Результаты исследования используются в курсе лекций по патологической физиологии (разделы «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Патофизиология системы крови», «Воспаление») и фтизиатрии (раздел «Иммунитет и аллергия при туберкулезе») на лечебном и педиатрическом факультетах ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.Исследования проведены при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям РФ (ГК №02.445.11.7419 «Молекулярные и клеточные основы управления реактивностью системы крови при актуальных заболеваниях инфекционной природы»; ГК №02.412.11.2040 «Молекулярные основы персонализированной терапии социально-значимых инфекционных заболеваний и прогнозирование исхода взаимодействия инфектогена и иммунной системы макроорганизма») и Совета по грантам при Президенте РФ (НШ-1051.2003.04 «Молекулярные механизмы нарушений структуры, метаболизма и функций клеток крови при патологии»; НШ-4153.2006.7 «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток крови при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы»).Публикации. По теме диссертации опубликованы 29 работ, из них 12 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.^ Объем и структура работы. Диссертация изложена на 366 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 96 таблицами. Библиографический указатель включает 382 источника, из них 225 отечественных и 157 зарубежных авторов.^ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Обследованы 298 больных с распространенным деструктивным туберкулезом легких. Пациенты находились на стационарном лечении в Томской областной противотуберкулезной больнице (гл. врач – Янова Г.В.) во фтизиотерапевтических отделениях №1 (зав. отд. – Новосельцева О.И.), №2 (зав. отд. – Малиновская Т.З.), №3 (зав. отд. – Янов А.А.). На завершающем этапе лечения больные наблюдались на базе Томского областного противотуберкулезного диспансера (гл. врач – Мишустин С.П.). Клинический осмотр и обследование пациентов, сбор анамнеза, постановку диагноза и назначение соответствующих схем лечения осуществляли врачи-фтизиатры Томской областной туберкулезной клинической больницы (чл.-корр. РАМН, профессор Стрелис А.К., к.м.н. Янова Г.В., к.м.н. Филинюк О.В., к.м.н. Лещев А.С., к.м.н. Петрова Л.Е., Мельникова Т.И., Янов А.А., Щегерцов Д.А.). Диагноз туберкулеза легких устанавливался на основании данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты с обязательным рентгенологическим исследованием легких. Диагноз инфильтративного туберкулеза легких был выставлен 117 (39,26%) больным, диссеминированного – 103 (34,56%), фиброзно-кавернозного – 61 (20,47%), казеозной пневмонии – 17 (5,71 %). В ходе исследования все больные с туберкулезом легких были разделены на две основные группы в зависимости от чувствительности M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам: в первую группу вошли 188 больных, выделяющих M. tuberculosis, чувствительные к основным противотуберкулезным препаратам, во вторую – 110 больных, выделяющих M. tuberculosis с первичной множественной лекарственной устойчивостью (устойчивость к изониазиду, рифампицину и стрептомицину). Каждая группа дополнительно была разделена на подгруппы в зависимости от клинической формы заболевания. Для видовой идентификации и определения чувствительности M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам (методом абсолютных концентраций) производился посев мокроты на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2. Лечение больных туберкулезом легких проводилось в соответствии со стандартными схемами противотуберкулезной химиотерапии, включающими в себя интенсивную и поддерживающую фазы лечения. Обследование больных туберкулезом легких проводили до начала специфической противотуберкулезной терапии, после окончания курса интенсивной химиотерапии и после курса поддерживающей противотуберкулезной терапии. Группы сравнения составили 17 здоровых мужчин и женщин в возрасте от 18 до 50 лет и 17 пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ). Все лица, входящие в группу здоровых доноров, прошли медицинский осмотр в МЛПМУ «Поликлиника №5» (главный врач – Коваленко С.И.). В анамнезе не было обнаружено хронических инфекционных заболеваний, аллергических реакций. Частота заболеваемости острыми респираторными вирусными и бактериальными инфекциями не превышала 3 раз в год. Материалом исследования служила венозная кровь. Определение общего количества лейкоцитов, абсолютного и относительного числа их отдельных морфологических форм проводили общепринятыми гематологическими методами [Меньшиков В.В., 1987]. Выделение лимфоцитов и моноцитов периферической крови осуществляли на градиентах плотности фиколл-урографина (1,077 г/см3 и 1,083 г/см3 соответственно) [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992]. Концентрацию жизнеспособных клеток определяли в счетной камере Горяева с использованием 0,5% трипанового синего [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992]. Определение апоптотических лимфоцитов и моноцитов проводили методом люминесцентной фотометрии на основе индикации annexin V+ клеток («BD Biosciences», США). Апоптоз стимулировали путем добавления в клеточную суспензию Н2О2 с последующим культивированием клеток в течение 24 ч. Оценку экспрессии Fas/APO-1 (CD95+) на лимфоцитах периферической крови проводили методом иммунофлуоресценции с использованием набора моноклональных антител «Клоноспектр» (МедБиоСпектр, Россия). Активность УФО-индуцированной ДНК-репарации в лимфоцитах и моноцитах исследовали методом сцинтилляционной радиометрии. Обработку культур лимфоцитов крови и приготовление препаратов для хромосомного анализа лимфоцитов проводили по методу P.S. Moorhead et al. [1960]. Для стимуляции клеточного деления использовали 0,01% раствор колхицина («Fluka», Швейцария). У каждого обследуемого анализировали не менее 100 метафазных пластинок, учитывая общее количество клеток с хромосомными нарушениями, количество аберраций хромосом (на клетку), количество клеток с изменением числа и нарушениями структуры хромосом. Концентрацию железа, меди, марганца, цинка, магния, алюминия в лимфоцитах, моноцитах и плазме крови определяли методом эмиссионного спектрального анализа по спектру излучения атомов, а концентрацию натрия, калия и натрия – плазменно-фотометрическим методом, основанным на измерении интенсивности излучения атомов элементов, возбуждаемых в пламени [Кузяков Ю.Я. и соавт., 1990]. Оценку микровязкостных свойств плазматической мембраны мононуклеарных лейкоцитарных клеток крови осуществляли путем флуоресцентного зондирования с использованием флуоресцентного зонда пирен [Добрецов Г.Е., 1989]. Выделение плазматических мембран мононуклеарных лейкоцитов проводили путем разделения клеточных компартментов в двухфазной системе декстран (500 000)-ПЭГ 6000 [Финдлей Дж., Эванс С., 1991]. Изучение липидного спектра мембран мононуклеарных лейкоцитов периферической крови осуществляли поэтапно с использованием метода тонкослойной хроматографии: выделение липидного экстракта [Folch J et al., 1957]; определение содержания общих фосфолипидов [Колб В.Г., 1982]; разделение основных классов фосфолипидов и нейтральных липидов [Жухоров Л.С., 1984]; определение процентного содержания фракций липидов; количественное определение фосфолипидов [Жухоров Л.С., 1984]; количественное определение холестерина [Карпищенко А.И, 2002]. Идентификацию фракций липидов осуществляли с использованием соответствующих стандартов фирмы «Sigma» (США). Исследование содержания ТБК-активных продуктов [Арутян А.В. и соавт., 2000] и диеновых конъюгатов [Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., 1983] в мононуклеарах периферической крови проводили методом спектральной фотометрии. Активность супероксиддисмутазы (адренохромовый методод) и каталазы (по убыли перекиси водорода) в мононуклеарных лейкоцитах периферической крови определяли спектрофотометрически [Арутян А.В. и соавт., 2000]. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы SPSS 12. Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий нормальности Шапиро-Вилка. Так как сформированные выборки не подчинялись нормальному закону распределения, то использовали непараметрические статистические критерии. Для определения достоверности различий при сравнении трех выборок и более применяли непараметрический аналог дисперсионного анализа – критерий Крускала-Уоллиса. Для множественных сравнений двух независимых выборок использовали критерий Данна. Для повторных измерений применяли критерий Фридмана. Для множественных сравнений двух зависимых выборок применяли критерий Даннета. Зависимости между переменными вычисляли с помощью коэффициента корреляции Спирмена R. Результаты представляли в виде выборочных средних (М), а также в виде медианы, верхнего (75%-го) и нижнего (25%-го) квартилей (Ме (Q1-Q2)). Для выявления значимых показателей (р^ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Туберкулез развивается и протекает наиболее тяжело при нарушении адекватного клеточного иммунного ответа, в первую очередь со стороны макрофагов и лимфоцитов [Сахарова И.Я. и соавт., 2003]. Исследования показателей клеточного иммунитета выявили, что течение туберкулезной инфекции ассоциировано с развитием синдрома вторичного иммунодефицита [Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2003; Сахно Л.В. и соавт., 2004; Яушев М.Ф. и соавт., 2004; Комогорова Е.Э. и соавт., 2005]. Наличие иммунодепрессии обусловливает нарастание частоты быстропрогрессирующих форм туберкулеза. Проведенные нами исследования показали, что у больных туберкулезом легких (ТЛ) до начала химиотерапии имеются достоверные нарушения количественных показателей белой крови по сравнению с соответствующими значениями у здоровых доноров, проявляющиеся увеличением ОКЛ (исключение составили пациенты с казеозной пневмонией и инфильтративной формой лекарственно-чувствительного ТЛ), лимфоцитопенией и моноцитозом. Основными механизмами, способствующими формированию лейкоцитоза, являются ускоренный выход лейкоцитов из костного мозга в кровь, стимуляция костномозгового кроветворения, выход клеток в циркуляцию из маргинального пула [Дыгай А.М., Клименко Н.А., 1992; Ляшенко В.А., 1995; Фрейдлин И.С., 1995; Гольдберг Е.Д. и соавт., 1997; Кашкин К.П., 1998]. Выявленная нами при ТЛ лимфоцитопения могла быть связана с истощением пула ранних и гибелью циркулирующих лимфоцитарных клеток [Черных Е.Р. и соавт., 2002; Сахно Л.В. и соавт., 2004; Яушев М.Ф. и соавт., 2004; Пичугин А.В., 2005], в том числе в связи с прямым действием туберкулезных токсинов [Чернов А.П., и соавт., 1998; Мишин В.Ю. и соавт., 2004]. Свой вклад в развитие лимфоцитопении, вероятно, может вносить дисбаланс со стороны эндокринной системы [Баласанянц Г.С. и соавт., 2000; Мишин В.Ю., 2004]. Большинство заболеваний органов дыхания сопровождаются общими клиническими симптомами, среди которых преобладают синдром интоксикации и бронхолегочные нарушения. При этом оценка специфичности изменений, характерных для туберкулезного процесса, является необходимым условием дифференцированного подхода к углубленному изучению данной патологии, разработке прогностических ее критериев и лечебно-реабилитационных программ. В результате при сравнении гематологических параметров у больных ТЛ и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) было установлено, что моноцитоз и лимфоцитопения характеризуют развитие туберкулезной инфекции, но отсутствуют при неспецифическом воспалении легких. Лимфоциты и циркулирующие моноциты являются одними из главных эффекторов противотуберкулезного иммунитета [Маянский А.Н., 2001; Каминская Г.О. и соавт., 2006]. Их численность в крови зависит от многих факторов, в том числе от активности апоптоза. Повышенная готовность лейкоцитов к апоптозу в настоящее время рассматривается в качестве одного из ключевых факторов подавления иммунного ответа не только при туберкулезе, но и при других инфекциях бактериальной и иной природы [Уманский Ю.А., 1996]. В связи с этим, важным представлялось провести комплексную оценку апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови при ТЛ. Проведенные исследования показали, что при разных формах ТЛ и у больных ХОБЛ отмечается сходная динамика изменений активности апоптоза мононуклеарных лейкоцитов. Так, у пациентов с ТЛ до начала лечения было выявлено увеличение количества аnnexin V-положительных лимфоцитов и моноцитов относительно соответствующих параметров у здоровых доноров и больных с обострением ХОБЛ (табл. 1). Кроме этого, было обнаружено, что содержание предуготовленных к апоптозу CD95+-лимфоцитов при ТЛ превышает аналогичные значения у здоровых доноров и при ХОБЛ. При оценке действия перекиси водорода, как неспецифического индуктора апоптотической гибели клеток, было установлено, что у больных ТЛ и ХОБЛ она опосредовала более выраженное, нежели у здоровых доноров, увеличение числа аnnexin V+ лимфоцитов и моноцитов in vitro по сравнению с уровнем спонтанной гибели клеток, не обработанных H2O2, что служит дополнительным свидетельством повышенной предрасположенности мононуклеарных лейкоцитов к апоптозу. Показано, что основной тип повреждений, который индуцирует перекись водорода – однонитевые разрывы. В свою очередь, возникающие повреждения увеличивают экспрессию белка р53, что приводит к активации проапоптотических белков (Bax, Bcl-xS, Bfl1), репрессии антиапоптотических факторов (Bcl-2, Bcl-xL) и апоптозу [Жукова О.Б. и соавт., 2006]. Вместе с этим, среди ученых до сих пор нет единого мнения о механизмах индукции апоптоза при ТЛ. Неизвестно насколько они специфичны для данной патологии. Учитывая вышеизложенное, нами было проведено сравнительное исследование, позволяющее выявить наиболее значимые показатели в запуске программы клеточной гибели у больных ТЛ и ХОБЛ. Для решения поставленной задачи был применен ковариационный анализ, где зависимой переменной являлся уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови. Предполагается, что чрезмерная экспрессия Fas-антигена является следствием дисбаланса активационных сигналов, обусловливающего включение программы гибели клеток при их стимуляции [Салина Т.Б., Худзик Л.Б., 2001]. В частности, Т. Hertoghe et al. [2000], А. Soruri et al. [2002] показали увеличение числа CD95+-Т-лимфоцитов у больных ТЛ. Этот феномен был зафиксирован также и в других научных публикациях [Бойчук С.В. и соавт., 2003; Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2003; Яушев М.Ф. и соавт., 2004; Пичугин А.В., 2005]. Вместе с тем, некоторыми исследователями было продемонстрировано, что механизм ассоциированного с ТЛ апоптоза опосредован подавлением bcl-2 [Klinger K. et al., 1997]. В последние годы появились данные о совместной роли CD95 и bcl-2-репрессии в индукции апоптоза [Hirsch C.S. et al., 2005; Mustafa T., 2007, 2008]. Роль CD95+ в запуске апоптоза подтверждается также результатами нашего исследования. Так, согласно данным ковариационного анализа, у больных с инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным ТЛ гиперэкспрессия СD95+ на лимфоцитах явилась значимым фактором, инициирующим их апоптотическую гибель (табл. 2). Таблица 1 Уровень апоптотических мононуклеаров в периферической крови у здоровых доноров, больных хронической обструктивной болезнью (ХОБЛ) и туберкулезом легких до начала лечения (М) Группы обследованных лиц Уровень annexin V+ клеток (%) Лимфоциты Р Моноциты Р Здоровые доноры 17,33 – 13,78 – Больные ХОБЛ 23,20 p1=0,0070 19,80 p1=0,0014 Больные ЛЧ ТЛ Инфильтративная форма 34,78 p1=0,0003 p2=0,0003 29,67 p1=0,0003 p2=0,0003 Диссеминированная форма 27,33 p1=0,0004 p3=0,0054 29,89 p1=0,0003 p2=0,0006 Фиброзно-кавернозная форма 38,00 p1=0,0003 p2=0,0002 p4=0,0010 32,44 p1=0,0003 p2=0,0002 Казеозная пневмония 25,50 p1=0,0054 p3=0,0087 p5=0,0055 27,00 p1=0,0054 p2=0,0133 Больные ЛУ ТЛ Инфильтративная форма 38,44 p1=0,0003 p2=0,0002 35,89 p1=0,0003 p2=0,0006 p6=0,0118 Диссеминированная форма 29,44 p1=0,0003 p2=0,0127 p3=0,0023 32,44 p1=0,0003 p2=0,0002 Фиброзно-кавернозная форма 33,11 p1=0,0003 p2=0,0005 p3=0,0104 p6=0,0118 32,44 p1=0,0003 p2=0,0002 Примечание: ЛЧ ТЛ – лекарственно-чувствительный туберкулез легких; ЛУ ТЛ – лекарственно-устойчивый туберкулез легких; p1 – уровень статистической значимости различий по сравнению с показателями у здоровых доноров; p2 – по сравнению с аналогичными показателями у больных ХОБЛ; p3 – по сравнению с показателями при инфильтративной форме; p4 – по сравнению с показателями при диссеминированной форме; p5 – по сравнению с показателями при фиброзно-кавернозной форме; p6 – по сравнению с показателями у больных лекарственно-чувствительным ТЛ (для каждой формы и этапа исследования).Таблица 2 Факторы, оказывающее влияние на апоптоз лимфоцитов у больных туберкулезом легких до начала терапии Форма туберкулеза Показатель Достоверность Больные ЛЧ ТЛ Инфильтративная форма Число CD95+-лимфоцитов р Число лимфоцитов с изменением количества хромосом р Число хроматидных разрывов в лимфоцитах р Число хромосомных обменов в лимфоцитах р ИС ДНК-репарации лимфоцитов р Содержание ТБК-а в лимфоцитах р Уровень меди в лимфоцитах р Диссеминированная форма Число CD95+-лимфоцитов р Уровень марганца в лимфоцитах р Уровень натрия в лимфоцитах р Фиброзно-кавернозная форма Уровень натрия в лимфоцитах р Уровень цинка в лимфоцитах р Содержание СФМ в мембране мононуклеаров р Содержание ФС в мембране мононуклеаров р Казеозная пневмония – – Больные ЛУ ТЛ Инфильтративная форма ХС/ФЛ в мембране мононуклеаров крови р Уровень железа в лимфоцитах р=0,00001 Уровень натрия в лимфоцитах р=0,00002 Уровень меди в лимфоцитах р=0,00004 Диссеминированная форма Содержания СФМ в мембране мононуклеаров р Содержание ФИ в мембране мононуклеаров р Уровень меди в плазме р Уровень магния в плазме р Фиброзно-кавернозная форма Микровязкость мембраны лимфоцитов р=0,00003 Уровень марганца в плазме р Здесь и далее: ЛЧ ТЛ – лекарственно-чувствительный туберкулез легких, ЛУ ТЛ – лекарственно-устойчивый туберкулез легких; ИС – индекс стимуляции, ТБК-а – ТБК-активные продукты, ДК – диеновые конъюгаты, СОД – супероксиддисмутаза, СФМ – сфингомиелин, ФИ – фосфатидилинозитол, ФС – фосфатидилсерин, ЛФЛ – лизофосфолипиды.Таким образом, течение ТЛ характеризуется увеличением содержания аnnexin V- и CD95-положительных лимфоцитов в крови, что имеет место при всех вариантах заболевания и, вер