Теория хроматографии, хроматографический анализ, виды хроматографии
Для объяснения явлений, происходящих при хроматографии, длярасчета длины колонок, положения и формы пиков, для выбора оптимальных условийпроцессов существует два подхода — теория теоретических тарелок (ТТТ) икинетическая теория. Согласно ТТТ, хроматографическую колонку можно представитьв виде ряда узких соприкасающихся слоев, называемых теоретическими тарелками. Полагается,что в каждой такой тарелке устанавливается равновесие между ПФ и НФ. Чем большетаких равновесий, тем эффективнее разделение. Обычно для оценки эффективностиколонки используют ВЭТТ Н и число теоретических тарелок N:чем больше N, или чем меньше н, тем эффективнее колонка.
Несмотря на то, что ТТТ содержит ряд расчетных уравнений,она не может объяснить, как скорость потока и характеристики наполнителя влияютна ширину зоны и, следовательно, на H и N. Это привело к появлению кинетической теории.
Кинетическая теория основана на скорости миграции вещества вколонке, которая определяется соотношением времени, проводимого молекулой в ПФи НФ. эффективность колонки в кинетической теории связывают с кинетическимпараметром — временем удерживания tr. Из соотношения /> следует, чточем больше tr, тем эффективнее колонка.
С позиций кинетической теории становится объяснимым фактсовпадения формы хроматографического максимума с гауссовой кривой. В статистикесимметричной колоколообразной гауссовой кривой описывают частоту (вероятность) появленияотклонений случайного характера измеряемой величины от ее среднего значения прибольшом числе повторных измерений. Но и величина скорости молекул, движущихсяпо хроматографической колонке, тоже носит статистический характер. Вследствиехаотичного движения молекул они на своем пути претерпевают множество случайныхстолкновений. Поэтому одни молекулы могут продвигаться быстрее, чем другие. Границыхроматографической зоны при этом расширяются. Положительные и отрицательныеотклонения случайного характера от среднего значения скорости движения молекулприводят к распределению молекул в хроматографической зоне, описываемомугауссовой кривой.
На продвижение частиц влияет ряд факторов, искажающих формупика (делающих их несимметричными) и снижающих эффективность колонки, а именно:1) структура НФ (размеры гранул, их однородность, плотность и равномерностьзаполнения колонки); 2) скорость установления равновесия сорбция-десорбция(массообмен); 3) диффузия молекул из зоны с большей концентрацией в зону сменьшей концентрацией.
Влияние этих факторов на эффективность колонки учитываетсяуравнением Ван-Деемтера:
/>,
где /> – скорость потока, A и В — константы, связанные со скоростью потока икоэффициентом диффузии в ПФ; C — константа, связанная смассообменом.
Из графического представления этого уравнения (рис.2.7.1) можносделать вывод, что существует оптимальная скорость потока, при которой Нминимальная. Чтобы найти эту точку, продифференцируем данное уравнение иприравняем производную к нулю: />, откуда /> = 2/>, а подставив /> в исходное уравнение,получим />+2/>. Такимобразом, кинетическая теория дает основу для оптимизации хроматографическогопроцесса.
Виды хроматографии
Рассмотрим особенности наиболее широко применяемых видовхроматографии.
Газовая хроматография — это метод, ПФ в которой являетсяинертный газ (азот, гелий, водород). Анализируемую пробу в виде смеси газов илижидкой смеси в паровое состояние вводят в поток ПФ. Неподвижной фазой служитлибо твердое вещество (газотвердофазная или газоадсорбционная хроматография — ГАХ),либо жидкость, нанесенная на твердый инертный носитель или на внутреннююповерхность капилляра (газожидкостная — ГЖХ или газораспределительнаяхроматография). В аналитической химии чаще используют газораспределительнуюхроматографию.
Твердый инертный носитель должен обладать высокоразвитой капиллярнойструктурой, этому соответствует, например, кизельгур (диатомит) — разновидностьгидратированного силикагеля (твердой кремниевой кислоты). Часто ее обрабатываютреагентами, которые переводят группы Si — OH в группы Si — O- Si (СН3) 3, что повышает инертность носителя поотношению к разделяемым веществам (способ силанизации). Таковыми являются,например, носители “хромосорб W” и “газохром Q”.
На кизельгур наносят жидкую неподвижную фазу. Можно выделитьтри типа неподвижных фаз: неполярные (например, сквалан), умеренно полярные(например, динонилфталан), полярные (например, диметилформамид). Полярностьнеподвижной фазы должна быть близка к полярности анализируемой пробы, напримернеполярные пентан, бутан и пропан хорошо разделяются на сквалане. Иногда вкачестве подвижной фазы используют органические соединения, ковалентносвязанные с носителем (химически связанные фазы). Такие фазы менеечувствительны к повышению температуры. Носителем с неподвижной фазой равномернозаполняют трубку (материал: стекло, нержавеющая сталь, полимер), получаютхроматографичеcкую насадочную колонку. Размеры колонок,используемых для аналитических целей, составляют: внутренний диаметр 2-6 мм идлина до 20м (поэтому сгибают в спираль). Для препаративных задач могутиспользоваться насадочные колонны больших размеров.
Капиллярные колонки чаще изготавливают из кварцевого стекла,имеют внутренний диаметр 0,2 — 0,5 мм и длину 10 — 100 м. Внутренняяповерхность капилляра смачивается теми же жидкими фазами, что и в предыдущемварианте. Капиллярные колонки по разделительной способности более эффективны,чем насадочные колонки, поэтому такой вариант часто называют высокоэффективнойгазовой хроматографией.
В колонку, продуваемую газообразной подвижной фазой, вводятанализируемую пробу: газообразную смесь удобнее с помощью крана-дозатора,жидкая — с помощью хроматографического шприца (объем пробы мал: 0,1-50 мкл). Жидкиеи твердые пробы перед введением в колонку должны быть переведены в парообразноесостояние. Выходящие из колонки компоненты можно детектировать различнымиспособами и получать хроматограммы в виде пиков.
Для получения выходной хроматографической кривой используютдетектор и регистратор.
Детектор (определитель, анализатор) реагирует на какое-либосвойство газа-носителя и анализируемых веществ. Наиболее распространеннымиявляются детектор по теплопроводности (ДТП или катарометр) ипламенно-ионизационный детектор (ПИД).
Катарометр преобразует зависимость теплопроводности среды отконцентрации вещества в хроматографической смеси в электрический аналитическийсигнал. Электрическая схема катарометра представляет собой электрическиймостик, в одно плечо которого вставлена металлическая проволочка, находящаяся втоке газа-носителя, а в другое плечо вставлена точно такая же проволочка,омываемая газом-носителем с определяемыми веществами хроматографической смеси. Дохроматографирования оба плеча катарометра омываются инертным газом и обепроволочки имеют одинаковое электрическое сопротивление, постоянство котороговыписы-вается регистратором (самопишущем потенциометром) в виде нулевой линиихроматограммы. При поступлении в катарометр зоны вещества изменяетсятеплопроводность среды в плече катарометра, соответственно изменяетсятеплопроводность среды и электрическое сопротивление проволочки. Причёмсопротивление меняется точно так же, как распределено вещество вхроматографической зоне, т.е. по закону Гаусса, графическим изображениемкоторого является симметричная колоколообразная кривая (пик). Зависимость
R = f(c) преобразуется электрической схемой катарометра вэлектрический аналитический сигнал, который выводится на регистратор,выписывающий зависимость в виде пика хроматограммы.
В качестве регистратора используют самопишущий потенциометрили более современное устройство хранения и математической обработки информации- персональный компьютер.
ПИД состоит из водородной горелки, расположенной между двумяэлектродами. При сгорании компонентов в пламени горелки происходит ихионизация, а в электрической схеме ПИД возникает ток ионизации,пропорциональный концентрации компонентов в смеси. Зависимость тока ионизацииот концентрации выводится на регистратор. В современных хроматографаханалоговый сигнал с детектора поступает на аналогово-цифровой преобразователь,информация с которого обрабатывается персональным компьютером. С помощью ПКудается автоматизировать весь хроматографический анализ.
Для проведения газовой хроматографии используют газовыехроматографы различных моделей.
Жидкостная хроматография может проводиться в колоночном и плоскостномвариантах. По механизму разделения жидко-твердую хроматографию называют такжежидкостной адсорбционной, а жидкость-жидкостную — просто распределительной.
В колоночной жидкостной адсорбционной хроматографии вкачестве НФ применяют поверхностно-пористые адсорбенты (ППА). ППА — это твердыесферические зерна (например, стеклянные шарики), на поверхность которых наносятсиликагель, оксид алюминия или некоторые полимеры, обеспечивающие слой свысокой пористостью толщиной около 1 мкм. ПФ — это растворитель, который долженхорошо растворять все компоненты анализируемой смеси, быть химически инертнымпо отношению к ним, адсорбенту и кислороду воздуха, быть маловязким. Как и вгазовой хроматографии, анализ проводят по времени удерживания и площади пика. Приэтом детектироваться может разность показателей преломления между чистымрастворителем и раствором после прохождения через колонку (рефрактометрическийдетектор) или разность в светопоглощении в видимой (фотометрический детектор),УФ — или ИК — лучах.
В колоночном варианте распределительной хроматографии ПФслужит органический растворитель, не смешивающийся с НФ. НФ обычно служит вода,адсорбированная на твердом носителе. В качестве носителей чаще используютсиликагель (твердая кремниевая кислота), целлюлозу, крахмал и другие вещества,хорошо удерживающие молекулы воды на своей поверхности.
Эффективность колонки связана с вязкостью, коэффициентомдиффузии и другими физическими свойствами жидкостей. Хроматографирование наколонке особо вязких жидкостей — длительный процесс, поскольку их продвижениечерез пористый носитель под действием силы тяжести очень мало. Для ускоренияпроцесса хроматографирование проводят под давлением, создаваемsvнасосом высокого давления. Применение давления сделало метод более динамичным иэффективным, что и отразилось в его названии — высокоэффективная жидкостнаяхроматография (ВЭЖХ).
Плоскостным вариантом жидкостной адсорбционной хроматографииявляется тонкослойная хроматография (ТСХ), а жидкость-жидкостной — бумажная (БХ).ТСХ и БХ очень близки по технике выполнения. НФ (силикагель, крахмал,целлюлоза, Al2O3 и др.) в ТСХнаносится тонким слоем на стеклянную, металлическую (алюминиевую фольгу) илипластиковую пластинку, а в БХ в качестве НФ обычно служит вода, адсорбированнаяна твердом носителе — специальной хроматографической бумаге.
Для проведения анализа каплю анализируемой смеси наносят настартовую линию в 2…3 см от края пластинки или полоски бумаги и высушивают. Затемкрай носителя погружают в растворитель (вода, органический растворитель),который действует как ПФ. При этом растворитель не должен касаться нанесенногопятна. Носитель можно подвесить так, чтобы поток растворителя двигался сверхувниз (нисходящая хроматограмма) и наоборот (восходящая) или от центра к краям(радиальная).
/>
Рис. 1. Способ обработки бумажной хроматографии.
Под действием капиллярных сил растворитель движется вдольслоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит ких пространственному разделению. Когда фронт растворителя достигнет требуемогоуровня, хроматограмму вынимают из растворителя, дают ему испариться, затемпроводят проявление пятен распределившихся веществ путем опрыскиванияхроматограммы реагентом с помощью пульверизатора и последующего облученияУФ-лампой. В химических методах проявления в реагент добавляют реактивы, дающиес анализируемыми веществами окрашенные соединения. В физических методахиспользуют, например, способность некоторых веществ флуоресцировать поддействием УФ — лучей, для чего в проявитель добавляют флуоресцирующийиндикатор. На проявленной хроматограмме обычно измеряют расстояния, пройденныерастворителем L и компонентом lза определенное время и находят величину R= l/L (рис. 1). При качественноманализе применяют метод “свидетелей”, для чего на линию старта рядом санализируемой смесью наносят индивидуальные вещества. Сравнивая значения R индивидуальных веществ и компонентов смеси, проводят ихотождествление.
Для количественного анализа измеряют обычно площади зонкомпонентов на хроматограмме (например, с помощью миллиметровой кальки или др.)и по заранее полученному градуировочному графику зависимости S= f(n) находят количествовеществ. Но применяют и другие варианты, например, выпаривают или удаляютвещества с носителя и затем определяют их количества в объеме полученногораствора.
В основе ионообменной хроматографии лежит обратимыйстехиометрический обмен ионов анализируемого раствора на подвижные ионысорбентов, называемых ионитами или ионнообменниками. Причиной разделенияявляется различная способность ионов анализируемого раствора к обмену.
В качестве ионитов используют природные или синтетические,твердые, нерастворимые в воде неорганические и органические высокомолекулярныекислоты, основания и их соли, содержащие в своем составе активные (ионогенные) группы.Иониты делятся на катиониты и аниониты.
Катиониты — сорбенты, способные к обмену катионами. катионитысодержат в своем составе ионогенные группы различной степени кислотности,например сульфогруппу — SO3H,карбоксильную группу — COOH, ион водорода которыхспособен к катионному обмену.
Химическую формулу катионитов схематично изображают RSO3-H+, RSO3-Na+ или просто [R] H,[R] Na, где R- сложный органический радикал. Наиболее часто применяются сильнокислотныекатиониты марок КУ-1, КУ-2, СДВ-2 и др.
Схема катионного обмена:
[R] H + Ме+ [R] Ме + H+
Аниониты — сорбенты, способные к обмену анионами.
Аниониты содержат в своем составе основные ионогенные группы,например, аминогруппы различной степени замещения: — NH2,=NH, N, = NH2OH, NH OH, способные к обмену гидроксид-ионов на различные анионы. Формулыанионитов схематично изображают: RNH3+OH-, RNH3+Cl — или просто [R] OH, [R] Cl. Cхема анионного обмена:
[R] OH+A — [R] A+OH —
Применяют аниониты марок АВ-17, АН-1, ЭДЭ-10 и др.
Существуют также амфотерные иониты — сорбенты, способные какк катионному, так и к анионному обмену.
Поглощение ионов зависит от природы и структуры ионита,природы анализируемых веществ, условий проведения эксперимента (температуры, pH и др.). Каждый ионит способен поглощать определенноеколичество ионов, т.е. обладает определенной емкостью. Различают статическуюобменную емкость (СОЕ) — количество ммоль эквивалентов иона, поглощенного заопределенное время 1 г сухого ионита, и динамическую обменную емкость (ДОЕ) — количествоэквивалентов ионов, поглощенных слоем ионита высотой 20 см и поперечнымсечением 1 см2 при скорости пропускания 0,5 дм3/ч.
Эффект поглощения данного иона характеризуется коэффициентомраспределения
Красп = />,
где Сионит и Ср-р — равновесные концентрации ионов всоответствующих фазах; m — масса ионита; г; V — объем водной фазы, см3.
Ионный обмен является физико-химическим процессом, поэтомуна коэффициент разделения влияют как химические, так и чисто физические факторы.
К химическим относятся следующие факторы: рН раствора,природа разделяемых ионов, их концентрация в растворе, склонность к гидратации,химический состав ионита и т.д. Например, с увеличением рН катионит увеличиваетобменную емкость, а анионит — уменьшает.
К физическим факторам относятся: скорость протеканияраствора через колонку, размер зерен ионита, высота колонки, температурараствора и т.д.
Для достижения оптимального разделения существенно подобратьнеобходимое количество ионита. Если известна константа распределения Красп иемкость данного ионита Q, то величина отношения массыионита (m, г) к объему анализируемого раствора (V, см3), которая обеспечит уменьшение концентрации иона Меn+ в растворе от начальной величины Сн до требуемого значенияСк,
/>.
Перед анализом ионообменную колонку регенерируют, т.е. переводятзаполняющий ее ионит в определенную ионообменную форму. Зарядка катионита Н+ионами, а анионита ОН ионами проводится путем пропускания через колонкуопределенного количества кислоты или основания. Затем ионит отмывают водой отизбытка кислоты или основания и пропускают через него с определенной скоростьюанализируемый раствор. Колонку промывают водой или другим элюентом, собираяэлюат целиком или по фракциям. Ионы, поглощенные ионитом, могут быть элюированысоответствующим растворителем. Катионы, как правило, элюируют кислотой:
[R] Me + H+ [R] H + Me+;
а анионы — щелочью:
[R] A + OH [R]OH +A.
Ионообменную хроматографию применяют в следующих случаях:
1) для разделения компонентов анализируемой смеси, отделениякатионов и анионов, разделения катионов, разделения анионов и т.д. Например,при добавлении к смеси ионов Cu2+, Zn2+,Cd2+, Pb2+, Bi3+соляной кислоты образуются хлоридные комплексы [CuCl4] 2-,[ZnCl4] 2-, [CdCl4] 2-, [PbCl3] -, [BiCl4] —, стойкостькоторых растет от Cu к Bi. Припропускании через анионитную колонку комплексы поглощаются. Далеепоследовательно вымывают металлы разбавленной HCl, H2O и HNO3: 2-молярнымраствором HCl вымывают Cu, 0.6М HCl — Zn, 0.3М HCl — Cd, H2O — Pb, HNO3- Bi;
2) для получения аналитических концентратов. при пропусканиибольших объемов разбавленных растворов через слой ионита и последующемизвлечении поглощенного вещества малым объемом растворителя возможно повышениеконцентрации вещества в 200-500 раз;
3) для обнаружения ионов. Разработаны методы выделения иобнаружения всех наиболее важных ионов.
Гельхроматография — это совершенно своеобразный видхроматографии, основанный на использовании различия в размерах молекулразделяемых веществ. Метод называют также гельфильтрационным или ситовым. НФявляется растворитель, находящийся в порах геля. Гелем называют студнеобразныеколлоидные растворы, в которых разбухшие частицы твердой фазы равномернораспределены в жидкой фазе.
Гель готовят на основе природных (крахмал, агар-агар) илисинтетических (декстран, полиакриламид и др.) соединений.
В процессе гельхроматографирования могут быть отделенымелкие частицы, способные проникать в поры геля, от крупных. Меняя составрастворителя, можно менять степень набухания твердой фазы и, следовательно,размеры пор геля, что позволяет проводить тонкие разделения смесей.