Г. А. Пенькова, А. А. Филиппов, И. Л. Голованова, Е. С. Степина
Ртуть занимает одно из ведущих мест среди тяжелых металлов, оказывающих токсическое воздействие на живые организмы. Она принадлежит к числу тиоловых ядов, блокирующих сульфгидрильные группы белков, входящих в состав важнейших для организма ферментов. Ртуть также реагирует с -СООН и -NH2 группами белков с образованием прочных комплексов – металлопротеинов. Нарушение нормальной работы белков-ферментов приводит к глубоким нарушениям в организме, и прежде всего, в центральной нервной системе и в почках.
Продолжительность жизни ртути в атмосфере невелика (несколько дней), однако в почве и воде она составляет сотни тысяч лет [9]. Наиболее токсичны органические соединения ртути, в состав которых входит метиловая группа. Поступая в организм с водой и пищей, метилртуть мигрирует по пищевым цепям как в водной, так и в наземно-воздушной среде, вызывая специфические отравления и заболевания у человека и животных. В то же время показано, что в малых количествах ртуть увеличивает иммунологическую устойчивость организма [10], а также повышает линейно-массовые размеры у рыб [1, 3].
Установлено, что ртуть вызывает значительные изменения белкового, липидного и углеводного обменов у позвоночных [3, 7]. Соединения ртути влияют на активность всех мембранных ферментов, в том числе и митохондриальных, участвующих в процессах энергопродукции [7]. При действии ртути у млекопитающих выявлены изменения активности антиоксидантных ферментов в печени и почках [12], а также изменения активности аргиназы и митоген- активируемой протеинкиназы [13, 14]. Накопление ртути, поступающей с пищей, вызывает разнонаправленные изменения активности и кинетических характеристик пищеварительных гли- козидаз рыб [2, 4, 6].
Поскольку углеводы играют важную роль в энергетическом и пластическом обмене, для оценки физиолого-биохимического состояния в условиях антропогенного загрязнения особую актуальность представляет изучение влияния ртути на гидролиз углеводов в кишечнике животных. В то же время действие накопленной в организме ртути на пищеварительные ферменты млекопитающих из природных популяций изучено крайне слабо [8]. Рыжая полевка – мелкий мышевидный грызун – характеризуется высокой численностью, коротким жизненным циклом (до 750 дней) и высокой скоростью метаболизма. Она является удобным объектом для изучения влияния ртути на переваривание углеводов, поскольку в ее рационе преобладают семена различных трав и деревьев, лесные ягоды, зелёные части растений.
В связи с этим цель работы состояла в изучении влияния накопленной в кишечнике ртути на активность гликозидаз в тканях и содержимом кишечника рыжей полевки Myodes glareolus Schreber из различных биотопов Воронежского заповедника.
Материалы и методы
Рыжие полевки средней массой 16-22 г отловлены осенью 2009 г. на разных биотопах (ольшаник, дубрава, осинник) Воронежского Биосферного заповедника. Ольшаник – наиболее влажный участок, затопляемый в половодье р. Усмань, дубрава – обширный участок склона (угол наклона
Полевок отлавливали с помощью давилок Ге- ро на стандартную приманку – хлеб, обжаренный в подсолнечном масле. На каждом биотопе выставляли по 50 давилок (на 10 дней) на расстоянии 5 м друг от друга. После поимки зверьков взвешивали и проводили биологический анализ. Кишечники изымали и хранили при температуре -18°С не более двух недель. Всего в работе использовано 40 особей, разделенных на группы по половой принадлежности и содержанию ртути в стенке кишечника.
В лабораторных условиях кишечник очищали от жира и прилегающих тканей, отделяли медиальную часть кишечника и разрезали ее вдоль. При помощи пластмассового скребка удаляли химус, а слизистую оболочку кишечника промывали охлажденным до 2-4°С раствором Рингера для теплокровных животных (152 ммоль NaCl, 5,7 ммоль KCl, 26 ммоль CaCl2, 1,8 ммоль NaHCO3, рН 7,4) для удаления остатков химуса. Кишечную стенку, наряду с химусом, использовали для приготовления исходного гомогената. Пробы ферментативно-активных препаратов готовили при помощи стеклянного гомогенизатора, добавляя охлажденный до 2-4°С раствор. Растворы субстратов (1,8 % крахмала и 50 ммоль сахароза) готовили на таком же растворе Ринге- ра. Гомогенаты и растворы субстратов инкубировали при постоянном перемешивании в течение 30 или 60 мин при температуре 20°С, рН 7,4.
В стенке и химусе кишечника определяли in vitro активность гликозидаз: мальтазы КФ 3.2.1.20 (глюкозооксидазный метод), сахаразы КФ 3.2.1.48 (метод Нельсона), а также амилоли- тическую активность, отражающую суммарную активность ферментов, гидролизующих крахмал: а-амилазы, глюкоамилазы КФ 3.2.1.3 и мальтазы КФ 3.2.1.20 (метод Нельсона) [11]. Для определения активности мальтазы применяли набор для клинической биохимии «Фотоглюкоза» (ООО «Импакт», Россия). Ферментативную активность определяли в пяти повторностях и выражали в микромолях продуктов реакции, образующихся за 1 мин инкубации ферментативно-активного препарата и субстрата в расчете на 1 г влажной массы ткани (мкмоль/г-мин). Определение ртути проводили атомно-абсорбционным методом с использованием анализатора ртути РА-915. Результаты представлены в виде средних и их ошибок (M ± m). Достоверность различий оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA, LSD-тест) при p = 0,05.
Результаты и обсуждение
Наибольшее накопление ртути в стенке кишечника и химусе рыжей полевки из дубравы и ольшаника существенно превышало аналогичные показатели у грызунов из более сухого биотопа осинник (табл. 1, 2). У отдельных самцов из дубравы содержание ртути достигало 60 мкг/кг сырой массы кишки и 126 мкг/кг сырой массы химуса. Содержание ртути в почвах исследованных биотопов снижалось в ряду ольшаник > дубрава > осинник [5] и положительно коррелировало с накоплением ртути в кишечнике (r = 0,77) и химусе (r = 0,60) самок. Наибольшие различия в уровне накопления ртути также отмечены у особей более влажных биотопов: содержание ртути в кишечнике различалось в 43 раза, в химусе – в 84 раза, в то время как у особей из осинника – лишь в 3 и 18 раз соответственно.
Уровень активности гликозидаз в тканях и химусе кишечника полевок достаточно высок, что хорошо согласуется с высоким содержанием углеводов в пище этих животных. Сравнение ферментативной активности у самцов и самок с близким содержанием ртути в кишечнике внутри одного биотопа позволило выявить половые различия (табл. 1). Так, при меньшем уровне накопления ртути у самок из осинника амилолитиче- ская активность и активность мальтазы выше на 38 и 29 %, активность сахаразы, напротив, ниже на 33 %, чем у самцов. У самок из ольшаника амилолитическая активность на 19 % ниже по сравнению с самцами, активность мальтазы и сахаразы примерно равна. Амилолитическая активность в химусе самок из осинника и ольшаника на 40 и 23 % ниже, чем у самцов, изменения активности других гликозидаз менее выражены (табл. 2). При более высоком уровне накопления ртути активность исследованных ферментов в стенке кишки и химусе у самок в большинстве случаев ниже, чем у самцов.
При анализе влияния накопленной ртути на активность гликозидаз у полевок с разных биотопов показаны разнонаправленные изменения амилолитической активности (табл. 1). У самцов по мере накопления ртути отмечено как увеличение (на 10-87 %, ольшаник, осинник), так и снижение (на 20 %, дубрава) ферментативной активности. У самок достоверное увеличение амилолитической активности на 41 % отмечено лишь в дубраве. Активность сахаразы в большинстве случаев снижается (на 16-48 %), лишь у самцов из ольшаника отмечено увеличение ферментативной активности на 40 %. Статистически достоверные изменения активности мальтазы с увеличением содержания ртути в кишечнике отмечены лишь у полёвок из ольшаника: у самцов она увеличивается на 11 %, а у самок снижается на 13 %.
Таблица 1
Влияние накопленной ртути на активность гликозидаз слизистой оболочки кишечника рыжей полевки
из различных биотопов
Биотоп
Пол
n,
Hg, мкг/кг сырой
Ферментативная активность, ммоль/г-мин
экз.
массы кишечника
Амилолитическая
Сахараза
Мальтаза
Ольшаник
в
7
3
5,4 ± 0,7
25,7 ± 1,8 ***
28,00 ± 0,62
30,67 ± 0,85 *
3,89 ± 0,09
5,44 ± 0,25 ***
8,08 ± 0,17
9,00 ± 0,10 **
?
3
4
4,2 ± 1,5
24,3 ± 5,0 **
22,67 ± 0,30 21,60 ± 1,03
4,27 ± 0,13
3,60 ± 0,18 *
8,67 ± 0,16
7,58 ± 0,08 ***
Дубрава
в
2
4
5,5 ± 0,8
35,3 ± 9,5 *
24,07 ± 0,67
19,27 ± 0,54 **
3,57 ± 0,15
2,53 ± 0,06 ***
7.92± 0,29
7.92± 0,26
?
2
3
12,0 ±0,0
19,7 ± 1,8 *
15,40 ± 0,64
21,73 ± 0,58 ***
2,96 ± 0,08 2,88 ± 0,14
7,75 ± 0,10 7,58 ± 0,44
Осинник
в
3
3
3,4 ± 0,0
8,3 ± 0,4 ***
15,11 ± 0,12
28,33 ± 0,91 ***
9,20 ± 1,18
4,77 ± 0,07 **
5,96 ± 0,13 6,38 ± 0,13
?
3
3
3.8± 0,4
6.8± 1,6
20,89 ± 0,49 20,40 ± 0,95
6,20 ± 0,03
4,43 ± 0,01 ***
8,09 ± 0,13 8,26 ± 0,10
Примечание. Здесь и в табл. 2. В числителе группа с меньшим содержанием ртути, в знаменателе – с большим содержанием ртути; различия показателей у особей с разным содержанием ртути внутри одного биотопа статистически достоверны: * – p
Сравнительный анализ активности гликозидаз у полевок одного биотопа при низком содержании ртути показал, что амилолитическая активность в химусе у самок ниже, чем у самцов на 22-40 % (табл. 2). Различия в активности сахаразы и мальтазы носят разнонаправленный характер.
С ростом накопления ртути в химусе рыжей полевки отмечены разнонаправленные изменения активности всех изученных ферментов. Максимальное увеличение амилолитической активности на 97-99 % отмечено у особей обоего пола из ольшаника.
Таблица 2
Влияние накопленной ртути на активность гликозидаз химуса рыжей полевки из различных биотопов в осенний период
Биотоп
Пол
n,
экз.
Hg, мкг/кг сырой массы химуса
Ферментативная активность, ммоль/г-мин
Амилолитическая
Сахараза
Мальтаза
Ольшаник
в
7
5,7 ± 1,0
9,33 ± 0,35
1,68 ± 0,06
6,04 ± 0,16
3
43,7 ± 6,2 ***
18,40 ± 0,34 ***
2,01 ± 0,11 *
8,94 ± 0,23 ***
?
3
4
5,3 ± 1,9
27,0 ± 2,5 ***
7,20 ± 0,31
14,33 ± 0,26 ***
1,44 ± 0,04 1,60 ± 0,03
7,23 ± 0,33 7,74 ± 0,09
Дубрава
в
2
4
17,3 ± 11,8 58,5 ± 22,9
10,53 ± 0,83
6,80 ± 0,56 **
1,30 ± 0,08
0,64 ± 0,03 ***
8,09 ± 0,13
6,38 ± 0,00 ***
?
2
3
14.0± 0,0
16.1± 11,5
6,73 ± 0,12 6,67 ± 0,18
1,55 ± 0,04
1,28 ± 0,06 **
6,64 ± 0,10 6,72 ± 0,09
Осинник
в
3
3
4,0 ± 0,0
7,3 ± 0,5 ***
13,93 ± 0,40
10,33 ± 0,32 ***
0,91 ± 0,01
2,25 ± 0,33 **
6,81 ± 0,10
6,11 ± 0,11 **
?
3
3
7,1 ± 2,2 11,4 ± 6,3
8,33 ± 0,15
11,87 ± 0,23 ***
1,07 ± 0,03
1,52 ± 0,06 ***
5,89 ± 0,13
7,73 ± 0,44 **
Активность сахаразы у полевок из биотопов ольшаник и осинник увеличивается на 11-148 %, а у животных из дубравы снижается на 17-51 %. Максимальное увеличение активности мальтазы на 48 % отмечено у самцов из ольшаника, а максимальное снижение на 21 % – у самцов из дубравы.
В большинстве случаев активность ферментов химуса, отражающая не только активность панкреатических ферментов консумента, но и активность тканевых ферментов жертвы и энтеральной микробиоты, с ростом содержания ртути изменялась в большей степени по сравнению с ферментами кишечной стенки (преимущественно слизистой оболочки). Эти результаты хорошо совпадают с данными, полученными ранее при исследовании бурозубки обыкновенной Sorex araneus [8]. Различия в величине и направленности эффектов могут быть обусловлены как большей адаптационной пластичностью панкреатической а- амилазы по сравнению с собственно кишечными ферментами, так и различиями характеристик ферментов, функционирующих в составе слизистой и химуса.
Ранее было показано, что накопление ртути в кишечнике бурозубок из тех же биотопов Воронежского заповедника и различных биотопов Череповецкого района Вологодской обл. на порядок выше, чем у рыжей полевки [5, 8]. У бурозубок из более влажных биотопов, почвы которых содержали большее количество металла, накопление ртути в органах и тканях выше, чем у животных из относительно сухих биотопов [5]. Несмотря на то, что у рыжей полевки из различных биотопов Воронежского заповедника показано большее накопление ртути в тканях и химусе кишечника особей, обитающих в более влажных условиях, в отличие от бурозубок, оно не зависит от концентрации металла в почве. Активность гликозидаз слизистой оболочки кишечника бурозубок, как правило, снижалась лишь при самых высоких концентрациях ртути, негативно влияя на скорость гидролиза углеводных компонентов пищи. Незначительное повышение содержания ртути приводило к достоверному повышению активности гликозидаз [8].
Уровень амилолитической активности и активности сахаразы в кишечнике рыжей полевки на порядок выше, чем у насекомоядной бурозубки, что хорошо согласуется с меньшим содержанием углеводов в пище последней. Именно этим можно объяснить отсутствие четкой зависимости активности гликозидаз от содержания ртути в тканях кишки рыжей полевки. Свидетельством в пользу данного предположения служит достоверное снижение активности гликозидаз с ростом содержания ртути у самцов из дубравы и самок из ольшаника, для которых характерны большие различия (в 5,8-6,4 раза) в накоплении металла в тканях кишечника.
Таким образом, при изучении рыжей полевки из различных биотопов Воронежского заповедника (ольшаник, дубрава, осинник) показано большее накопление ртути в тканях и химусе кишечника особей, обитающих в более влажных условиях. В большинстве случаев активность гликозидаз у самок ниже, чем у самцов. Накопление ртути сопровождалось разнонаправленными изменениями активности гликозидаз, гидролизующих углеводные компоненты пищи. Достоверное снижение активности гликозидаз, свидетельствующее о снижении скорости начальных этапов усвоения углеводов, отмечено при наибольшем содержании ртути в кишечнике. Активность ферментов химуса, отражающая не только активность панкреатических ферментов консу- держания ртути изменялась в большей степени мента, но и активность тканевых ферментов по сравнению с кишечными ферментами. жертвы и энтеральной микробиоты, с ростом со-
Список литературы
1. Глубоков, А. П. Рост трех видов рыб в ранние периоды онтогенеза в норме и в условиях токсического воздействия [Текст] / А. П. Глубоков // Вопр. ихтиологии. – 1990. – Т. 39, № 1. – С. 137-143.
2. Голованова, И. Л. Влияние ртути на гидролиз углеводов в кишечнике речного окуня Perca fluviatilis [Текст] / И. Л. Голованова, В. Т. Комов // Вопр. ихтиологии. – 2005. – Т. 45, № 5. – С. 695-701.
3. Голованова, И. Л. Влияние тяжелых металлов на физиолого-биохимический статус рыб и водных беспозвоночных [Текст] / И. Л. Голованова // Биология внутр. вод.- 2008. – № 1. – C. 99-108.
4. Голованова, И. Л. Гидролиз углеводов в кишечнике плотвы Rutilus rutilus (L.) при различном накоплении ртути в организме [Текст] / И. Л. Голованова, В. Т. Комов, В. А. Гремячих // Биология внутр. вод. – 2008. – № 3. – С. 102-108.
5. Комов, В. Т. Содержание ртути в почвах и в мелких млекопитающих различных биотопов воронежского заповедника [Текст] / В. Т. Комов,
B. А. Гремячих, C. Ф. Сапельников, Ю. Г. Удоденко // Ртуть в биосфере : эколого-геохимические аспекты. Матер. Межд. симп. Москва, 7-9 сент. 2010. – М. : ГЕОХИ РАН, 2010. – С. 281-286.
6. Кузьмина, В. В. Влияние повышенного содержания ртути в корме рыб на процессы экзотрофии у карпа [Текст] / В. В. Кузьмина, В. Т. Комов, В. А. Гремячих, П. В. Русанова, А. В. Гладков // Антропогенное влияние на водные организмы и экосистемы. Матер. IV Всерос. конф. по водной экотоксикологии, посвящ. памяти Б. А. Флерова. – Борок, 2011. Ч. 1. –
C. 146-150.
7. Немова, Н. Н. Биохимические эффекты накопления ртути у рыб [Текст] / Н. Н. Немова. – М. : Наука, 2005. – 164 с.
8. Пенькова, Г. А. Влияние накопленной ртути на гидролиз углеводов в кишечнике бурозубок различных экологических групп [Текст] / Г. А. Пенькова,
Е. С. Степина, А. А. Филиппов, И. Л. Голованова,
Н.Я. Поддубная // Ртуть в биосфере : экологогеохимические аспекты. Матер. Межд. симп. – М. : ГЕОХИ РАН, 2010. – С. 309-314.
9. Скрипниченко, И. И. Биоценологические исследования ртути в ландшафтах Русской равнины [Текст] / И. И. Скрипниченко, Б. Н. Золотарева // Поч- венно-биоценологические исследования центра Русской равнины. – Пущино : ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1981. – С. 82-103.
10. Соколов, О. А. Атлас распределения тяжелых металлов в объектах окружающей среды [Текст] /
О.А. Соколов, В. А. Черников, С. В. Лукин. – Белгород : Константа, 2008. – 188 с.
11. Уголев, А. М. Определение активности инвер- тазы и других дисахаридаз [Текст] / А. М. Уголев,
Н.Н. Иезуитова // Исследование пищеварительного аппарата у человека. – Л. : Наука, 1969. – С. 192-196.
12. Filipak Neto F.: Toxic effects of DDT and methyl mercury on the hepatocytes from Hoplias malabaricus [Text] / Neto F. Filipak, S.M. Zanata, H.C. Silva de Assis, L.S. Nakao, Randi M.A.F., C.A. Oliveira Ribeiro // Toxicol. in Vitro. 2008. 22. № 7. – P. 1705-1713.
13. Kanada Hironori: Downregulation of arginase II and renal apoptosis by inorganic mercury: Overexpression of arginase II reduces its apoptosis [Text] / Kanada Hironori, Kikushima Makoto, Homma-Takeda Shino, Sumi Daigo, Endo Akiko, Toyama Takashi, Miura Nobuhiko, Naganuma Akira, Kumagai Yoshito // Arch. Toxicol. 2008. 82, № 2. – P. 67-73.
14. Kim Sang Hyun: Mercury induces multidrug resistance-associated protein gene through p38 mitogen- activated protein kinase [Text] / Kim Sang Hyun, Bark Hyun, Choi Cheol Hee // Toxicol. Lett. 2005. 155. № 1. – P. 143-150.
Для подготовки данной работы были использованы материалы с сайта http://vestnik.yspu.org
Дата добавления: 05.05.2014