ЯМР как аналитический метод Донецк 2008 Введение В этой работе на разнообразных примерах показано, каким образом ЯМР может быть использован в качестве аналитического метода. С этой целью более подробно обсудим некоторые понятия. Применение метода ЯМР в качестве аналитического можно продемонстрировать на примере простейшей молекулы
– молекулы этанола, поскольку, как видно из рис. 1, протонам трех функциональных групп в этаноле: метильной, метиленовой и гидроксильной соответствуют три различные резонансные линии, наблюдаемые в спектре. Особенность метода ЯМР прежде всего состоит в том, что по положению резонансных линий в спектрах можно судить о взаимном расположении отдельных атомов или групп атомов в молекулах, причем это удается обнаружить даже для эквивалентных атомов. ЯМР по своей информативности выгодно отличается от многих других аналитических
методов, конкурирующих с ним. В то же время ЯМР является довольно малочувствительным методом, несмотря на то, что в современных спектрометрах значение максимально достижимого магнитного поля составляет 14 Тл, что соответствует рабочей частоте для 1H 600 МГц. Минимальное количество вещества, которое может быть зарегистрировано с помощью метода ЯМР 1H, варьируется в широких пределах в зависимости от условий эксперимента.
Для малых молекул типичное значение, определяющее предел чувствительности, составляет 10 нмоль, т.е. то количество вещества, которое может быть проанализировано простыми биохимическими методами, например, с помощью тонкослойной хроматографии. При использовании других, достаточно широко используемых методов, таких, как газовая хроматография или радиоиммунометрия, становятся доступными принципиально иные с точки зрения чувствительности области такие, как фемто- и атоммолярная. Таким образом, если речь идет только о регистрации спектров веществ известной структуры, то эти методы по чувствительности превосходят ЯМР. Преимущество ЯМР становится очевидным лишь тогда, когда возникает необходимость в получении дополнительной информации, которую может предоставить только этот метод. Это касается тех случаев, когда структура исследуемого вещества еще не известна. Тогда из анализа спектра ЯМР можно построить ряд возможных структур и выбрать среди них правильную.
Следует отметить также еще одну особенность метода ЯМР: в спектрах ЯМР 1H могут присутствовать сигналы молекул-примесей, идентификация которых возможна только в случае применения специальных методов. 1. Идентификация известных и неизвестных веществ Использование метода ЯМР в качестве аналитического в простейшем случае состоит в сравнении положений линий спектров образца
неизвестной структуры и стандартного образца известной структуры: совпадение спектров стандартного вещества и исследуемого позволяет провести идентификацию последнего. На основании такого рода сопоставлений можно дать даже количественную оценку концентрации веществ, содержащихся в образце. Эта оценка в простейшем виде может быть сформулирована следующим образом: вещество А содержится в образце в концентрации, достаточной для его регистрации.
Правда, такой способ оценки справедлив лишь тогда, когда оба сравниваемых спектра получены при идентичных условиях. Реальный спектр, соответствующий определенному веществу, существенно зависит от условий его регистрации. Вид спектра определяется не только внешними факторами, т.е. теми параметрами, которые экспериментатор может контролировать самостоятельно, но и используемым растворителем. Несмотря на это, все же удается провести идентификацию неизвестного вещества, поскольку всегда можно ограничиться определенным абстрактным уровнем и сравнить характерные особенности спектров. Рассмотрим еще раз фрагмент спектра ЯМР этанола, снятого на современном ЯМР-спектрометре с высоким значением постоянного магнитного поля. Параметры, полностью характеризующие спектр, следующие: положение спектральных линий, структура мультиплетов и относительные интенсивности резонансных линий. Положение линий определяется значением химического
сдвига, а расщепление линий – скалярным спин-спиновым взаимодействием. Площадь под резонансным сигналом, которая может быть получена численным интегрированием, пропорциональна числу спинов, соответствующих данной группе в молекуле. Как было показано ранее, химический сдвиг можно понимать как усиление или ослабление внешнего магнитного поля в точке пространства, в которой расположено исследуемое ядро.
Основной вклад в величину этого локального изменения поля дают электронные оболочки рассматриваемых молекул, поэтому можно утверждать, что химический сдвиг отражает структуру молекул. Если оценивать влияние заместителей на величину химического сдвига, то с ростом числа связей между рассматриваемым атомом и заместителем это влияние уменьшается. Однако характер электронного распределения, а значит, и вид спектра
ЯМР, зависит и от пространственной структуры молекул, и от взаимодействия с другими молекулами в растворе, т.е. от тех факторов, которые уже не представляются столь очевидными. Для ЯМР область значений химических сдвигов невелика, а эффекты, связанные с пространственной структурой и вызванные взаимодействием с другими молекулами, бывают настолько велики, что часто из наблюдения спектров ЯМР весьма затруднительно сделать однозначный вывод о химической структуре вещества. Таблица 1. Химический сдвиг в спектрах Ни С Для большинства молекул в растворе конформация их при комнатной температуре не является жесткой, они могут существовать в виде нескольких различных конформаций. Устанавливаемое конформационное равновесие зависит от состава растворителя, температуры и давления. Кроме того, исследуемые молекулы могут взаимодействовать между собой или с другими молекулами и образовывать при этом более или менее стабильные комплексы. Вероятность обнаружения этих взаимодействий зависит от
концентрации всех компонентов, присутствующих в растворе. В отличие от спектров ЯМР 1H диапазон значений химических сдвигов в спектрах С существенно больше», так что положение резонансных линий в спектрах 13C определяется в основном химической структурой. Значения химических сдвигов характеристичны при условии, что влияние заместителей учитывается в виде аддитивной поправки к величине химического сдвига.
2. Внутренний и внешний стандарт Химический сдвиг, как правило, приводится относительно резонансной частоты вещества-стандарта, которое добавляется в исследуемый раствор или помещается в капилляр. В этом случае, как показано ранее, химический сдвиг зависит от резонансной частоты используемого стандарта. Величина химического сдвига имеет смысл только в случае, если указан стандарт, относительно которого приводится его значение. В табл. приведены основные вещества, используемые в качестве стандартов.
Если же химический сдвиг приведен относительно другого вещества, используемого в качестве стандарта, то его значение всегда можно пересчитать относительно общепринятого стандарта. Как внешний, так и внутренний стандарты обладают рядом преимуществ и недостатков. Внутренний стандарт может вступать во взаимодействие с другими молекулами, присутствующими в растворе, что приводит к сдвигу сигнала стандарта, т.е. к сдвигу нулевой точки. Взаимодействие стандарта с исследуемым веществом также может привести к изменению вида его спектра. Поэтому основным требованием, предъявляемым к внутреннему стандарту, является уменьшение этого эффекта. Очевидно, что внутренний стандарт должен быть химически стабильным соединением и хорошо растворимым в используемом растворителе. Всем этим условиям вполне удовлетворяют такие вещества, как тетраметилсилан, 2,2 – диметил 2 силапентан 5 сульфоновая кислота и триметилсилилпропионовая кислота, положение сигнала
метальной группы для которых используется в качестве нулевой точки в шкале химических сдвигов и м.д. Эти вещества используются в качестве стандартов в спектрах как 1H, так и 13C Для других ядер, спектры которых представляют интерес с точки зрения биологических приложений ЯМР таких, как 15N и 31P, пока не установлен единый стандарт.