Виробництво генно-інженерного інсуліну людини Оптимізація умов ферментативного гідролізу п

Назва реферату: Виробництво генно-інженерного інсуліну людини. Оптимізація умов ферментативного гідролізу при виробництвіРозділ: Біологія Виробництво генно-інженерного інсуліну людини. Оптимізація умов ферментативного гідролізу при виробництві У Російській Федерації, як і в усьому світі, постійно збільшується кількість хворих цукровим діабетом і в цей час воно досягає 2 млн. чоловік, з яких більше 400 000 мають потребу в щоденному прийомі інсуліну. Проблема забезпечення хворих цукровим діабетом препаратами інсуліну особливо загострилася з 1990 року після припинення виробництва ряду готових лікарських форм інсуліну через невідповідність їхньої якості світовому стандарту й заборони використання яловичих інсулінів, що становили 70 відсотків об’єму випуску. В останні роки більшість розвинених країн світу для лікування хворих цукровим діабетом використовують рекомбінантний інсулін людини, одержуваний генно-інженерними методами. В 2005 р. на закупівлю інсуліну Росія затратила 185 млн. дол. США. Реальним шляхом, що дозволяє покрити дефіцит інсуліну й знизити витрати валютних коштів, є створення в країні потужностей по виробництву вітчизняного рекомбінантного інсуліну людини. Інсулін відноситься до життєво важливих лікарських засобів, які Всесвітня організація охорони здоров’я рекомендує самостійно виробляти тим країнам, чиє населення перевищує 50 млн. чоловік. З 1923 року до 80-х років минулого століття інсулін вироблявся винятково із тваринної сировини, а саме з підшлункової залози свиней і великої рогатої худоби, і тільки в 1982 році вперше була створена можливість виробництва інсуліну людини методом генетичної зміни мікроорганізмів. У цей час частка генно-інженерного інсуліну людини в усьому світі неухильно зростає й в 2004 р. вона склала більше 70% від загального обсягу виробництва гормону. Структура людського інсуліну Молекула інсуліну являє собою поліпептид, що складається із двох ланцюгів – А и В (мал. 1); Мал. 1. Структура інсуліну й розбіжності в амінокислотній послідовності молекул інсуліну ссавців. Сірим кольором показані місця замін амінокислот, що найбільш часто зустрічаються. Ланцюги інсуліну ковалентно зв’язані між собою двома дисульфідними зв’язками АЗ7 і АЗ19. У молекулі інсуліну є також один дисульфідний зв’язок в А-ланцюга: А6-АН . Амінокислотна послідовність інсуліну людини й більшості ссавців добре відома . Локалізація всіх трьох дисульфідних містків постійна, а А- і У-ланцюга представників більшості видів містять 21 і 30 амінокислотних залишків, відповідно. В обох ланцюгах у багатьох положеннях зустрічаються амінокислотні заміни, що не впливають на біологічну активність гормону, однак найпоширенішими є заміни в положенні 8.9 і 10 А-ланцюга (табл. 1). Таблиця 1:Амінокислотна послідовність інсуліну різних ссавців Ссавці Амінокислоти А-ланцюга в положенні Амінокислоти У-ланцюга в положенні 8 9 10 30 Людина Треонін Серин Ізолейцин Треонін Бик Аланін Серин Валіи Аланін Свиня Треонін Серин Ізолейцин Аланін Собака Треонін Серин Ізолейцин Аланін Кашалот Треонін Серин Ізолейцин Аланін Кролик Треонін Серин Ізолейцин Серин Кит Аланін Серин Треонін Аланін Із цього слідує, що дана ділянка, швидше за все, не має вирішального значення для біологічної активності інсуліну. Деякі структури молекули інсуліну мають високу консервативність. У їхньому числі положення трьох дисульфідних містків, гідрофобні залишки в С-кінцевій ділянці В-ланцюга й С- і N-кінцеві ділянки А-ланцюга. Використання хімічних модифікацій і замін окремих амінокислотних залишків у цих ділянках допомогли ідентифікувати структуру активного центра інсуліну. Розташована на С-кінці В-ланцюга гідрофобна ділянка бере участь також у димеризації інсуліну. Цинк, концентрація якого в β-клетках острівців Лангерганса досягає високих значень, формує комплекси з інсуліном. Інсуліни всіх хребетних утворюють димери за допомогою водневих зв’язків між пептидними групами залишків В24 і В26 двох мономерів, які при високих концентраціях гормону, у свою чергу, реорганізуються в гексамери, що містять по два атома цинку в кожному. Наявність таких высоковпорядкованих комплексів істотно полегшило вивчення кристалічної структури інсуліну. При фізіологічних концентраціях інсулін перебуває в мономерній формі. Одержання генно-інженерного інсуліну людини. В 1980 р. американськими вченими Міллером і Бакстером був уперше описаний процес клонування людського гена в Е. coli з наступною індукцією й одержанням білка, ідентичного людському . Цим білком був інсулін людини. У промислових умовах рекомбінантний інсулін уперше отриманий американською фармацевтичною компанією Eli Lilly разом з біотехнологічною компанією Genentech (США). Перший ГЕННО-ІНЖЕНЕРНИЙ ІНСУЛІН ЛЮДИНИ надійшов на фармацевтичний ринок в 1982 р. У цей же час компанія «Novo-Nordisk» (Данія) розробила технологію одержання ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ, засновану на використанні генетично модифікованих дріжджових культур у ролі суперпродуцентів інсуліну людини. Використання еукаріот, що мають подібну з людською систему процессінгу білків, у ролі продуцентів інсуліну дозволило одержати гормон або його попередника в нативній формі. Значною перевагою даної технології є повна відсутність у препараті бактеріальних ендотоксинів і пірогенів клітинної стінки. Незважаючи на всі ці переваги одержання інсуліну з використанням бактеріальних штаммів-суперпродуцентів залишається кращим завдяки більше високому рівню експресії інсуліну в складі гібридного білка. У цей час генно-інженерний інсулін виготовляють шляхом ферментації генетично змінених мікроорганізмів (кишкової палички, дріжджів), які здатні синтезувати попередник інсуліну (проінсулін) у складі химерного протеїну. З отриманого біосинтетичним шляхом проміжного продукту ензиматичним шляхом реконструюють інсулін людини. Виробнича схема процесу наведена в табл. 2 . Таблиця 2: Принципова схема виробництва ГЕНО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ № стадії Технологічний процес 1 Культивування штаму Е. coli з вбудованим геном гібридного білка, що включає повну послідовність інсуліну людини 2 Очищення й ренатурація ГБ 3 Протеолітичне розщеплення ГБ с одержанням інсуліну 4 Очищення інсуліну Дана схема багато в чому нагадує процес біосинтезу інсуліну в острівцях Лангерганса, де гормон спочатку з’являється у вигляді білка-попередника (проінсулину), а потім протеолітичними ферментами від проінсулину відщеплюється сполучний С-пептид у спеціальних везикулах. У виробництві для розщеплення ГБ використають подібні по специфічності ферменти: трипсин і карбоксипептидазу В. Гідроліз проводять шляхом обробки ферментами послідовно або одночасно. Сучасне виробництво генно-інженерного інсуліну людини в Росії. В 1996 році в Російській федерації прийнята цільова федеральна програма «Цукровий діабет», що передбачає створення виробничих потужностей по виробництву генно-інженерного інсуліну людини. У рамках цієї роботи вчені з ВАТ «Національні біотехнології» (п. Оболенськ, Московська область) при участі співробітників Інституту біоорганічної хімії (ІБХ) РАН і Державного інституту кровозамінників і медичних препаратів за 4 роки спільної роботи створили штам-продуцент гібридного білка Е. coli JM109/pPINS07 і лабораторну методику одержання ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ. Була проведена перевірка якості отриманого препарату й лікарських форм на його основі й підготовлене технічне завдання на проектування лінії потужністю 5-10 кг субстанції інсуліну в рік. На основі цих розробок ВАТ «Національні біотехнології» в 2003 р. була введена в експлуатацію дослідно-виробнича лінія по випуску субстанції ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ потужністю 10 кг/рік . Дана лінія відповідає вимогам для генетично-модифікованих продуктів Європейського Союзу й робить ГЕННО-ІНЖЕНЕРНИЙ ІНСУЛІН ЛЮДИНИ, що відповідає всім основним показникам якості у міжнародних фармакопеях. Принциповий технологічний процес виробництва ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ на підприємстві ВАТ «Національні біотехнології» представлений у табл. 3. Таблиця 3: Технологічна схема виробництва ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ на ВАТ «Національні біотехнології» № стадії Технологічний процес 1 Культивування штаму-продуцента Е. coli JM109/pPINS07 2 Руйнування клітин 3 Відділення осаду ГБ-сирцю центрифугуванням 4 Розчинення ГБ з одночасним відновленням нерегулярних S-S-зв’язків 5 Ренатурація ГБ з утворенням правильних S-S-зв’язків 6 Хроматографічне очищення ГБ на іонообмінному сорбенті (КМ-сефароза) 7 Гідроліз ГІБРИДНИЙ БІЛОК трипсином (одержання диаргинининсулина) 8 Хроматографічне очищення діаргінінінсуліну на іонообмінному сорбенті (SP-Sepharose FF) 9 Концентрування фракцій, що містять 90% діаргінінісуліну 10 Трансформація ДАІ карбоксипептидазою В (одержання первинного інсуліну) 11 Очищення первинного інсуліну методом фазової ВИСОКОЕФЕКТИВНОЇ РІДИННОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ до чистоти >96% 12 Хроматографічне очищення ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУЛЮДИНИ від високо- і низькомолекулярних домішок за допомогою гель-фільтрації 13 Кристалізація й перекристалізація інсуліну в присутності іонів Zn+2 14 Сушіння кристалів Zn-інсуліну Метод заснований на технології так названого «роздільного гідролізу», при якому ГБ піддається спочатку розщепленню трипсином з одержанням основного продукту — діаргінінісуліну , а потім ДАІ піддається хроматографічному очищенню, концентруванню й трансформації в первинний інсулін із чистотою не менше 92—96%. При такій послідовності проведення технологічного процесу порівняно нескладно очистити ДАІ від домішки дезтреонінінсуліну (інсуліну, у якому відсутній треонін у положенні ВЗО), однієї з найбільше важковидаляємих домішок інсуліну. Для збільшення об’єму інсуліну, що випускається, і зменшення собівартості кінцевого продукту на ВАТ «Національні біотехнології» було вирішено розробити й запустити у виробництво схему одержання ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ методом спільного гідролізу. Даний метод заснований на одержанні первинного інсуліну в одну стадію шляхом одночасного впливу трипсину й карбоксипептидази В на ГБ. При більш високій технологічності основна проблема спільного гідролізу полягає в пошуку оптимальних умов, при яких утвориться мінімальна кількість дезтреонінінсуліну. Визначення кількості цієї домішки в гідролізаті є важким (за одними даним він невіддільний від інсуліну , а за іншимі – від дезамідоінсуліну). Однак завдяки великій економії часу й реактивів метод спільного гідролізу в цей час є найпоширенішим і використовується для виробництва ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ як у Росії (ИБХ РАН), так і за рубежем (Eli Lilly, США, Biobras, Бразилія). Метою даної роботи був пошук оптимальних фізико-хімічних умов для проведення спільного (одностадійного)гідролізу ГБ. УМОВИ ЕКСПЕРИМЕНТУ. У ході експериментів використовували карбоксипептидазу В с активністю 200 од/мг і трипсин з активністю 239 од/мг виробництва ГосНИИгенетика (Росія). Основним методом визначення кількості й чистоти білків, що утворяться в ході гідролізу, була аналітична ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИННА ХРОМАТОГРАФІЯ, проведена на аналітичному ВЄЖХ-хроматографі «Dionex», США (колонка «Phenomenex», США, 250×4,6 мм, С18, розмір часток 5 мкм). Представлені хроматограми отримані при використанні програмного забезпечення «Chromeleon 6.0». Продуцентом ГБ був штам Е. coli JM109/pPlNS07, отриманий спільно співробітниками ВАТ «Національні біотехнології» і ІБХ. Ренатурований ГБ надходив на стадію гідролізу в 0,1 М трис-HCl у концентрації 8 ± 2 г/л. РЕЗУЛЬТАТИ. Як відомо, спільний гідроліз ГБ протікає у дві стадії: трипсиноліз ГБ до проміжних продуктів (ДАІ й МОНОАРГІНІНІНСУЛІН) і їх карбоксипептидоліз із утворенням інсуліну. Таким чином, трипсиноліз є визначальною, а карбоксипептидоліз – залежною стадією спільного гідролізу. Отже, всі продукти трипсинолізу ГБ будуть продовжувати утворюватися й під час реакції спільного гідролізу. Серед продуктів трипсинолізу ГБ крім ДАІ й МОНОАРГІНІНІНСУЛІНу у великій кількості містились домішки білоку (до 25% від загального білка), що має час виходу при ВЕРХ-аналізах трохи більше, ніж час виходу інсуліну. Завдяки цій його особливості білок був названий «правим плечем» (ПП) (мал. 2). Мал. 2. Порівняння ВЕРХ-хроматограм гідролізу в присутності (суцільна лінія) і під час відсутності (пунктир) внутрішнього стандарту інсуліну: I — пік внутрішнього стандарту інсуліну; II — праве плече; III — пік діаргінінінсуліну: IV — пік моноаргінінінсуліну. Даний білок утворювався й при проведенні спільного гідролізу (мал. 3). Мал. 3. ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИННА ХРОМАТОГРАФІЯ продуктів спільного (трипсин + карбоксипептидаза) гідролізу ГБ: I – інсулін; II – ПП Спроби очистити інсулін від даної домішки за допомогою іонообмінної і ВЕРХ-хроматографії призвели до великих втрат через те, що відділення ПП від інсуліну було важко виконати. Таким чином, головним завданням став пошук таких фізико-хімічних умов спільного гідролізу, при яких формується мінімальна кількість ПП. Підбор оптимальних рН і температури проведення спільного гідролізу ГБ Була виявлена строга залежність збільшення кількості ПП від підвищення температури (мал. 4). Мал. 4. ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИННА ХРОМАТОГРАФІЯ продуктів спільного гідролізу ГБ залежно від температури: I — інсулін; II — ПП; 1 — гідроліз при 13°; 2 — гідроліз при 24°; 3 — гідроліз при 30° Схожа картина була отримана при визначенні впливу рН на синтез ПП: кількість ПП збільшувалося при збільшенні рН. Отримані залежності нелінійні й при проведенні експериментів при низьких температурах (1—6°) і значенні рН у районі 7,1 ± 0,1 було з’ясовано, що результати гідролізу практично не змінюються, однак зміст ПП усе ще великий (до 2—5%). Експериментальним шляхом були знайдені оптимальні умови спільного гідролізу: рН = = 7,1 ±0,1 nt = 6± 1°. Визначення оптимальної концентрації ферментів для одностадійного гідролізу ГБ У результаті проведених експериментів було з’ясовано, що співвідношення ГБ : фермент впливає тільки на час гідролізу, але не на якість одержуваного продукту. Таким чином, головним при пошуку оптимальних концентрацій ферментів було визначення оптимального співвідношення трипсин : карбоксипептидаза В. При проведенні трипсинолізу було помічено, що якщо вчасно не зупинити реакцію, то концентрація ДАІ починає зменшуватися, а ПП – збільшуватися. У результаті було зроблено припущення про те, що ПП – продукт побічного впливу трипсину на ДАІ. Зменшення такого впливу при проведенні спільного гідролізу можливо тільки при збільшенні кількості карбоксипептидази В, що трансформує ДАІ в інсулін. У результаті проведених експериментів висунуте припущення було підтверджено й показанО, що при співвідношенні (по масі) карбоксипептидаза В : трипсин > 1,6:1 ПП у гидролизаті практично відсутній (мал. 5). Мал. 5. ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИННА ХРОМАТОГРАФІЯ продуктів спільного гідролізу ГБ при рН 7,0,14° і співвідношенні карбоксипептидаза В:трипсин = 2:1 Отриманий у результаті гідролізу первинний інсулін містив незначну кількість ПП, що легко видалялася при іонообменій хроматографії (наприклад, з використанням носіїв на основі сефарози). У результаті проведеної експериментальної роботи були визначені оптимальні фізико-хімічні умови проведення спільного гідролізу ГБ: температура реакційного середовища < 6°; рН = 7,1 ±0,1; співвідношення карбоксипептидаза В : трипсин > 1,6:1. При проведенні подальших досліджень білок ПП був виділений у чистому виді й ідентифікований методом мас-спектрометрії як дезтреонінінсулін. На основі отриманих даних виробництво ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ на ВАТ «Національні біотехнології» перейшло на більш технологічну схему одержання первинного інсуліну з ГБ методом спільного гідролізу. Ця схема містить у собі два етапи: гідроліз і хроматографічне очищення інсуліну на SP-Sepharose FF. Оптимальні умови проведення спільного гідролізу ГБ у промислових умовах наступні: рН = 7,1 ±0,l,t = 5± 1° і співвідношення (по масі) ГБ: карбоксипептидаза В : трипсин = 2000:1,6:1. Тривалість процесу гідролізу становить 15 ± 1 ч. Нова технологічна схема процесу дозволила знизити собівартість первинного інсуліну в 2,5 рази й збільшити потужність виробничої лінії з 10 до 30 кг субстанції ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ в рік. Використана література: Теоретический и научно-практический журнал «Биотехнология» Москва, 2006. № 4, С56-63.